Mikrobiologiczne zanieczyszczenia żywności - ebook

3 Biofilmy

Pasqualina Lagana, Gabriella Caruso, Francesco Mazzu, Giogia Caruso, Salvatore Parisi i Antonino Santi Delia

…Aby zoptymalizować nasze życie w mieście, musimy dokonać kilku wyborów. Po pierwsze wybrać miasto, w którym będziemy żyć, następnie sąsiedztwo, które najlepiej będzie odpowiadało naszym potrzebom, a także dopasować architekturę naszego domu do innych, znajdujących się w okolicy. Od czasu do czasu, kiedy życie w mieście stanie się nie do zniesienia, wyjeżdżamy….

P. Watnick, R. Kolter (2000) Biofilm, City of Microbes

Streszczenie: Biofilm jest to zbiorowość drobnoustrojów, którą cechują osiadłe komórki bakteryjne ściśle przylegające do substratu i/lub interfejsu oraz włączone do polimerowej matrycy pochodzenia mikrobiologicznego. W takich warunkach komórki mikrobiologiczne wykazują zmieniony fenotyp w porównaniu do odpowiadających im form życia, np. planktonu. Życie w biofilmie stanowi przeważający model wzrostu mikroorganizmów w różnych środowiskach. Po opracowaniu nowych metod obserwacji oraz wprowadzeniu zmian do różnych procedur możliwe jest zidentyfikowanie biofilmów na znanych podłożach, jak i w nowych miejscach. Koncepcja biofilmu zyskała na znaczeniu w sektorze służby zdrowia, a zwłaszcza w tych obszarach, gdzie wykorzystuje się narzędzia inwazyjne. Ponadto biofilmy odgrywają kluczową rolę w przemyśle spożywczym ze względu na bezpośrednią obecność na powierzchni żywności.

Słowa klucze: alginian, biofilm, celuloza, egzopolisacharyd, pozakomórkowa substancja polimerowa, N-acetyloglukozamina, succinoglikan

Wykaz skrótów:

CLSM mikroskopia konfokalna (ang. confocal laser scanning microscopy)

DNA kwas deoksyrybonukleinowy (DNA)

ES egzopolisacharyd

EPS pozakomórkowa substancja polimerowa

3.1. Wprowadzenie

Biofilm jest to zbiorowość drobnoustrojów, którą cechują osiadłe komórki bakteryjne przylegające do substratu i/lub interfejsu oraz włączone do polimerowej matrycy pochodzenia mikrobiologicznego. W takich warunkach komórki mikrobiologiczne wykazują zmieniony fenotyp w porównaniu do odpowiadających im form życia, np. planktonu.

Dowiedziono, że przyłączanie się bakterii oddziałuje na mechanizmy kontroli genów, przyczyniając się do powstawania niezbędnych cząsteczek podczas tworzenia biofilmów (Donlan i Costerton 2002). Definicja biofilmu obejmuje nie tylko opis o charakterze morfostrukturalnym, lecz także czynniki biomolekularne (Donlan 2002).

Opracowanie nowych metod obserwacji, takich jak scanningowa mikroskopia elektronowa, oraz wprowadzenie modyfikacji do różnych procedur umożliwiło identyfikowanie biofilmów na znanych podłożach, jak również na nowych miejscach. W ten właśnie sposób udało się wyjaśnić trwałe i odporne na działanie antybiotyków infekcje. W ostatnim czasie odnotowuje się powszechny wzrost zainteresowania zagadnieniem biofilmu z różnych perspektyw badawczych. Dlatego też przedmiotem badań stały się m.in. następujące mikroorganizmy:

- Candida albicans (Hawser i Douglas 1994; Sherry i in. 2014)
- Escherichia coli (Pratt i Kolter 1998)
- Klebsiella pneumoniae (di Martino i in. 2003)
- Legionella pneumophila (Atlas 1999; Declerck 2010; Declerck i in. 2007; Hindré i in. 2008; Murga i in. 2001; Storey i in. 2004)
- Proteus mirabilis (Holling i in. 2014; Jones i in. 2007; Moryl i in. 2014)
- Pseudomonas aeruginosa (Klausen i in. 2003; O’Toole i Kolter 1998; Ramsey i Whiteley 2004; Savoia 2014)
- Staphylococcus aureus (Kiedrowski i in. 2014; Islam i in. 2014; Wojtyczka i in. 2014).

3.1.1. Zewnątrzkomórkowe substancje polimerowe

Jak już zostało wspomniane, biofilm jest złożoną strukturą zbudowaną z agregatów komórek bakteryjnych w ramach matrycy pozakomórkowych substancji polimerowych (EPS). EPS są to składniki o wysokiej masie cząsteczkowej wydzielane przez mikroorganizmy do otoczenia.

Struktura matrycy stanowi elastyczną część biofilmu. Przestrzenie międzywęzłowe oraz kanały oddzielające mikrokolonie zawierają płyn rozdzielający, składający się głównie z wody. Płyn rozdzielający stanowi lepki element biofilmów. Matryca EPS zapewnia biofilmowi stabilność mechaniczną dzięki lepko sprężystym właściwościom (Shaw i in. 2004), jak również integralność funkcjonalną i integralną. Fizykochemiczne właściwości biofilmów są głównie determinowane przez jakościowy i ilościowy skład matryc EPS (Flemming i Wingender 2010).

W biofilmie mogą występować wszystkie ważniejsze rodzaje makrocząsteczek, takie jak polisacharydy, białka, kwasy nukleinowe, peptydoglikany i lipidy. Chociaż pozakomórkowe polisacharydy uznaje się za główne składniki strukturalne matrycy biofilmu, to jednak kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) odgrywa kluczową rolę przy tworzeniu struktur biofilmu (Whitchurch i in. 2002).

EPS stanowią materiał konstrukcyjny kolonii bakteryjnych i są przymocowane do zewnętrznych powierzchni komórki lub są uwalniane do pożywki wzrostowej. Składniki te są istotne przy tworzeniu biofilmu oraz podczas przywierania komórek do powierzchni. EPS stanowią 50–90% całkowitej materii organicznej w biofilmach (Donlan 2002; Donlan i Costerton 2002; Flemming i in. 2000).

Powstawanie biofilmów mikrobiologicznych można zaobserwować praktycznie na wszystkich podwodnych powierzchniach w środowiskach naturalnych, jak i przemysłowych. Biofilmy obserwuje się również na złączach w postaci kulek lub w większości środowisk wodnych w formie kłaczków albo granulek (Marti i in. 2011).

Mikroorganizmy syntetyzują szerokie spektrum wielofunkcyjnych polisacharydów, takich jak wewnątrzkomórkowe, strukturalne i pozakomórkowe polisacharydy lub egzopolisacharydy (ES). ES są to polimery o wysokiej masie cząsteczkowej, w ich skład wchodzą pozostałości cukrowe, które są uwalniane przez mikroorganizm do otoczenia. ES jest zasadniczo zbudowany z monosacharydów oraz różnych niewęglowodanowych podstawników, takich jak octan, pirogronian, bursztynian oraz grupy fosforanowe. Dzięki różnorodnej budowie ES znalazły szereg zastosowań w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym oraz w medycynie.

ES niektórych szczepów bakterii kwasu mlekowego, np. Lactococcus lactis subsp. cremoris, nadają galaretowatą strukturę produktom powstałym ze sfermentowanego mleka, takim jak Viili (jogurt powstały przy udziale mezofilnych bakterii fermentacji mlekowej). Ponadto te polisacharydy są przyswajalne (Ljungh i Wadstrom 2009; Welman 2009). Przykładem przemysłowego zastosowania ES jest zastosowanie dekstranu we włoskim cieście panettone oraz w pieczywie w przemyśle piekarniczym (Ullrich 2009).

Lembre wraz ze współpracownikami wykazali szereg przykładów ES i węglowodanów w biofilmie bakteryjnym (Lembre i in. 2012). Budowa ES może różnić się w zależności od pochodzenia od danego gatunku bakterii (por. rozdz. 3.1.1.1–3.1.1.3).

3.1.1.1. Alginian i N-acetyloglukozamina

W ostatnim czasie przeprowadzono szereg badań nad alginianem (por. rys. 3.1), polisacharydem pozyskiwanym od brunatnic oraz innych bakterii, takich jak Azotobacter vinelandii (Gorin i Spencer 1966) oraz P. aeruginosa (Davies i in. 1993; Davies i Geesey 1995; Linker i Jones 1964). Algnian klasyfikuje się jako ES o względnie wysokiej masie cząsteczkowej (10⁴–10⁶ g/ml). Składnik ten (Gacesa 1998) jest zbudowany z dwóch reszt kwasu uronowego: β-D-mannuronian, zwanego również M, oraz jego C-5 epimeru, α-L-guluronianu, zwanego również G (por. rys. 3.1).

Rys. 3.1. Egzopolisacharydy w matrycach biofilmu: budowa alginianów G i M. Struktury G oznaczają „poli-α-L-guluronian”, a bloki M „poli-β-D-mannuronian”. Rysunek opracowany na podstawie BKchem wersja 0.13.0, 2009 (http://bkchem.zirael.org/index.html)

Kolejnym ciekawym przykładem ES jest N-acetyloglukozamina (por. rys. 3.2). Jest ona wytwarzana przez E.coli, S. aureus i S. epidermidis (Cerca i Jefferson 2008; Kaplan i in. 2004; Izano i in. 2008).

3.1.1.2. Succinoglikan

Succinoglikan jest wytwarzany przez Alcaligenes faecalis var. myxogenes 10C3, mikroorganizm wyizolowany przez grupę badawczą kierowaną przez autorów niniejszego artykułu. Mikroorganizm ten wytwarza zarówno rozpuszczalny wodzie, jak i nierozpuszczalny pozakomórkowy polisacharyd. Succinoglikan składa się z glukozy, galaktozy, kwasu pirogronowego oraz kwasu bursztynowego (stosunek molowy 7:1:1:1) o wiązaniach glikozydowych (β1-3)-, (β1-4)- oraz (β1-6)-. Te polimery czy oligomery są wytwarzane przez różne szczepy Agrobacterium oraz Rhizobium (Harada 1983; Harada i Amemura 1979; Hisamatsu i in. 1982; Tomlinson i in. 2010).

3.1.1.3. Celuloza

Celuloza (por. rys. 3.3) jest najliczniejszym polimerem cukrowym występującym na powierzchni ziemi. Występuje on w świecie żywym: w roślinach, zwierzętach, grzybach oraz w bakteriach, takich jak Salmonella spp., E.coli, Acetobacter, Agrobacterium oraz Rhizobium (Matthysse i in. 2005; Solomon i in. 2005; Spiers i Rainey 2005).

Rys. 3.2. Budowa N-acetyloglukozaminy. Rysunek opracowany na podstawie BKchem wersja 0.13.0, 2009 (http://bkchem.zirael.org/index.html)

Rys. 3.3. Budowa celulozy. Rysunek opracowany na podstawie BKchem wersja 0.13.0, 2009 (http://bkchem.zirael.org/index.html)

3.2. Powstawanie biofilmu

Jak już zostało wspomniane, biofilmy stanowią skupiska mikroorganizmów przylegających do powierzchni i rosnących na niej (Costerton i Stewart 2001). Na powstawanie i rozwój biofilmów wpływ ma szereg różnych czynników, takich jak specyficzny szczep bakterii (Borucki i in. 2003; Chae i Schraft 2000), właściwości powierzchni materiałów czy parametry środowiska (wartość pH, dostęp do składników odżywczych oraz temperatura; Donlan 2002).

Powstawanie biofilmu jest procesem dynamicznym, składającym się z pięciu etapów:

(a) adhezja wstępna

(b) adhezja trwała

(c) powstawanie mikrokolonii

(d) utworzenie dojrzałej formy biofilmu

(e) migracja komórek i tworzenie nowych mikrokolonii (rozproszenie; por. rys. 3.4).

3.2.1. Adhezja wstępna

Początkowe przyleganie mikroorganizmów do powierzchni może być czynne lub bierne, w zależności od ich ruchliwości, grawitacyjnego przemieszczania się gatunków planktonowych (swobodny przepływ) czy też dyfuzji otaczającego płynu rozdzielającego (Kumar i Anand 1998). Właściwości fizyczne środowiska są istotne dla przylegania mikroorganizmu do podłoża, powstania biofilmu oraz procesów mikrobiologicznych. Adhezja komórek podczas tego procesu zależy w dużej mierze od parametrów fizykochemicznych powierzchni komórek bakteryjnych (Begoude i in. 2007). Na początku przylegające białka zawierają jedynie niewielką ilość EPS, wiele z tych form życia jest w stanie przemieszczać się niezależnie (O’Toole i Kolter 1998) poprzez drgania lub ślizganie się. Na tym etapie proces adhezji jest odwracalny (por. rys. 3.4).

Rys. 3.4. Etapy powstawania biofilmu: (a) adhezja wstępna; (b) adhezja trwała; (c) powstawanie mikrokolonii; (d) utworzenie dojrzałej formy biofilmu; (e) migracja komórek i tworzenie nowych mikrokolonii (rozproszenie)

3.2.2. Adhezja trwała (nieodwracalna)

Przejście biofilmu z fazy odwracalnej do nieodwracalnej jest związane z interakcją pomiędzy powierzchnią z wytwarzaniem EPS oraz obecnością bakterii (por. rys. 3.4). Na tym etapie komórki tracą zdolność do przemieszczania się, którą zapewniały im wici (Stoodley i in. 2002). Po zakończeniu fazy nieodwracalnego przywiązania potrzebna byłaby wyjątkowo mocna siła, aby usunąć biofilm. Niezbędne byłoby wówczas zastosowanie np. enzymów, detergentów czy substancji powierzchniowo czynnych. Badania McCoy i in. wykazały, że adhezja mikrobiologiczna zależy w dużej mierze od właściwości hydrofobowo-hydrofilowych danych powierzchni (McCoy i Brown 1998).