Biochromatografia - ebook

1
WPROWADZENIE

Chromatografia jako najważniejsza metoda analizy chemicznych związków organicznych jest powszechnie stosowana w laboratoriach analitycznych na świecie, w tym w Polsce. Jest ona nauczana w wielu wyższych uczelniach, a pomocą w nauczaniu są podręczniki. Napisaliśmy trzy książki na temat chromatografii – Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych, Chromatografia gazowa i Chromatografia cieczowa. Oprócz nich ważną rolę w nauczaniu chromatografii pełni książka Rajmunda Michalskiego pt. Chromatografia jonowa. Te książki zawierają informacje o istocie chromatografii, aparaturze chromatograficznej i jej wykorzystaniu, o czynnikach wpływających na rozdzielanie chromatograficzne, o wielkościach charakteryzujących to rozdzielanie oraz o chromatograficznej analizie jakościowej i ilościowej. Wiadomości zawarte w tych książkach dotyczą ogólnie zastosowania chromatografii do rozwiązywania różnych problemów analitycznych.

W ostatnich kilkudziesięciu latach, a szczególnie podczas pandemii COVID-19, bardzo wzrosło zainteresowanie naukami o życiu (ang. life sciences). Jest ono związane z koniecznością wykonywania analiz chemicznych związków biologicznie aktywnych, określanych skrótowo jako biozwiązki albo biocząsteczki. Coraz większego znaczenia nabiera analiza biofarmaceutyków, w tym substancji białkowych, stosowanych np. w szczepionkach. Konieczna jest charakterystyka dużych terapeutycznych białek, w tym monoklonalnych przeciwciał, przekaźnikowych kwasów rybonukleinowych (mRNA) oraz koniugatów przeciwciało–lek. Do tego rodzaju analiz doskonale nadaje się chromatografia. Bardzo wiele prac publikowanych w czasopismach analitycznych, w tym chromatograficznych, dotyczy analiz substancji biologicznie aktywnych. Analizy te mają bowiem zastosowanie w biochemii, biotechnologii, toksykologii, biologii, farmacji i medycynie (np. w zakresie terapii komórkowej i genowej), w badaniu żywności, kryminalistyce i do wykrywania dopingu w sporcie. W tym ostatnim przypadku pojawiło się nowe zagrożenie polegające na dopingu poprzez zmianę kodu genetycznego sportowców.

Wśród wielu zastosowań analitycznych chromatografii na uwagę zasługuje jej wykorzystanie do spersonalizowanego dobierania dawek leków poszczególnym pacjentom. Powszechnym postępowaniem jest przepisywanie na tę samą chorobę u różnych pacjentów takiej samej dawki leków i zalecanie takiego samego sposobu ich przyjmowania. Jednak metabolizm i usuwanie leków z organizmu poszczególnych ludzi przebiegają z różną szybkością. Dlatego stosowanie takiej samej dawki leków u różnych pacjentów może dawać różny skutek terapeutyczny. W dobrych szpitalach na świecie dobiera się pacjentom indywidualne, optymalne wielkości dawek leków. W tym celu po podaniu pewnej porcji leku chromatograficznie kontroluje się spadek jego stężenia we krwi, moczu lub ślinie w określonych odstępach czasu, np. co godzinę. Jednocześnie można kontrolować poziom metabolitów w płynach ustrojowych. Na podstawie wyników analizy lekarz dobiera właściwe dawki leku dla poszczególnych pacjentów i określa czas, po którym kolejna dawka powinna być przyjęta.

O znaczeniu i konieczności stosowania chromatografii w bioanalizach świadczy między innymi to, że według szacunków, wartość globalnego rynku biofarmaceutyków, rosnąca z szybkością ok. 7 % rocznie, w 2027 r. osiągnie ok. 65 mld dolarów. Nie jest możliwe osiągnięcie tej wartości bez proporcjonalnego wzrostu zapotrzebowania na analizy chromatograficzne.

Uwzględniając wymienione przesłanki, można zrozumieć dlaczego nauczanie chromatografii, ze znacznym uwzględnieniem elementów analizy substancji biologicznie aktywnych, jest bardzo ważne. Mając to na uwadze, w niniejszym podręczniku postanowiliśmy opisać poszczególne techniki chromatograficzne należące do biochromatografii, ich możliwości analityczne i zastosowanie. Opis tych technik odnosi się do ich właściwości i zastosowań bioanalitycznych, bez uwzględniania istoty chromatografii oraz podstawowych charakterystyk technik chromatograficznych. Tę szczegółową wiedzę czytelnik powinien przyswoić sobie przed przystąpieniem do czytania niniejszej książki, w której ograniczamy się do wiadomości potrzebnych do zrozumienia istoty poszczególnych technik, związanej z analizą biocząsteczek. Podstawowa wiedza dotycząca chromatografii jest opisana w naszych poprzednich książkach.

W niniejszej książce, bardziej szczegółowo niż w poprzednich, opisujemy powstanie i historię chromatografii. Uważamy, że tak ważna metoda analityczna, która została odkryta w Polsce, zasłużyła na to, żeby o jej powstaniu i rozwoju napisać więcej niż napisano dotychczas w języku polskim. Warto przy tym wspomnieć, że prof. Victoria Samanidou z Uniwersytetu w Salonikach zaproponowała ustanowienie Dnia Chromatografii. Swoją propozycję przedstawiła w czasopiśmie „Analytical Scientist”, 2019, nr 1, s. 17. Propozycją tą zainteresowali się członkowie Zespołu Chromatografii i Technik Pokrewnych KChA PAN. Z inicjatywy prof. Zygfryda Witkiewicza wniosek prof. Samanidou poparli uczestnicy XIII Konferencji Chromatograficznej, która odbyła się w czerwcu 2023 r. w Katowicach. Pismo popierające wniosek zostało wysłane do przewodniczących: Central European Group for Separation Sciences, prof. Bogusława Buszewskiego, The Chroatographic Society, prof. Tony Ege i American Chemical Society, prof. Judith Giordan. We wrześniu 2023 r. podczas Konferencji Chromatograficznej w Cluj, z inicjatywy prof. Buszewskiego, dwie z wymienionych wyżej instytucji przyjęły następującą deklarację.

Deklaracja

My niżej podpisani, reprezentujący Central European Group for Separation Sciences (CEGSS), Komitet Chemii Analitycznej Polskiej Akademii Nauk (CACh PASci), American Chemical Society (ACS) oraz The Chromatographic Society (ChromSoc) z inicjatywy prof. dr Victorii Samanidou z Salonik (Grecja) i prof. dr. Zygfryda Witkiewicza z Warszawy (Polska) ustanawiamy dzień 21 marca jako Międzynarodowy Dzień Chromatografii. Inicjatywa ta jest podjęta na pamiątkę wygłoszenia przez Michaiła S. Cwieta, profesora Uniwersytetu Warszawskiego, pierwszego referatu poświęconego chromatografii w dniu 21 marca 1903 roku podczas posiedzenia Warszawskiego Towarzystwa Naukowego.

Jako odpowiedzialni za kierowanie poniższymi organizacjami deklarujemy organizowanie każdego dnia 21 marca danego roku seminariów via internet z udziałem przedstawicieli wymienionych organizacji na temat Today and future in separation sciences jako wolnych wykładów i paneli dyskusyjnych.

Prof. Dr. Bogusław Buszewski Prof. Dr. Tony Ege

CEGSS & CACh PASci ChromSoc

Rozpowszechnienie, zgodnie z tą deklaracją, informacji o istocie i znaczeniu chromatografii dla ludzkości, doprowadziłoby do tego, że dzień 21 marca każdego roku byłby obchodzony na całym świecie jako Dzień Chromatografii. Niestety, prof. Judith Giordan, której w Cluj nie było, deklaracji nie podpisała. Dlatego Światowego Dnia Chromatografii jeszcze nie ma. Wydaje się jednak, że nie powinniśmy ustawać w staraniach o ustanowienie tego Dnia.

Niniejsza książka jest przeznaczona dla studentów kierunków studiów, które w swoich programach mają zagadnienia związane z chromatograficzną analizą substancji biologicznie aktywnych. Do kierunków tych należą np. biologia, biochemia, biotechnologia, farmacja, biomedycyna i przetwórstwo żywności.2
KRÓTKA HISTORIA CHROMATOGRAFII

Powszechnie przyjmuje się, że odkrywcą chromatografii był M.S. Cwiet. Istnieją jednak wcześniejsze publikacje, w których znajdują się opisy rozdzielania określane współcześnie jako wymiana jonowa, która jest podstawą chromatografii jonowej. Te publikacje w istocie nie odnoszą się jednak do rozdzielania, współcześnie rozumianego jako chromatograficzne, ale do usuwania pewnych składników, np. z wody przez ich adsorpcję na ciałach stałych. Pierwszy opis takiego uzdatnienia wody do picia znajduje się w biblijnej Księdze Wyjścia (15, 22–25) i dotyczy zdarzenia, które miało miejsce ok. 1225 r. p.n.e. Około roku 330 p.n.e. Arystoteles zalecał sączenie wody morskiej przez różne materiały w celu otrzymywania wody pitnej.

W czasach nowożytnych coraz lepiej poznawano istotę zachodzących procesów związanych z wzajemnym oddziaływaniem substancji. Około połowy XIX wieku H.S. Thompson, J. Spence i J.T. Way stwierdzili, że sól amonowa z roztworu wodnego może być zatrzymywana na złożu, z którego eluowany jest wapń. Był to dowód na wymianę kationów w materiale złoża. Takimi złożami były pierwotnie naturalne zeolity i humusy. Na rozdzielanie składników mieszanin w tych złożach, oprócz reakcji wymiany jonów, wpływały ich porowatość i efekty kapilarne. Te zjawiska odgrywały główną rolę w rozdzielaniach, które otrzymywał F.F. Runge (1794–1867), także w połowie XIX wieku. Po nakropleniu na bibułę mieszaniny barwnych składników otrzymywał on obraz składający się z pierścieni o barwach odpowiadających poszczególnym składnikom. Wyniki swoich prac opublikował w dwóch książkach: w 1850 r. pt. Zur Farben-Chemie. Musterbilder für Freunde des Schönen (Chemia kolorów. Obrazy dla kochających sztukę) oraz w 1855 r. pt. Der Bildungstrieb der Stoffe. Veranschaulicht in selbständig gewachsenen Bildern (Materiały tworzące obrazy. Samodzielnie powstające obrazy).

Współcześnie można spotkać się z poglądem, że odkrywcą chromatografii był Runge, który pracował na Śląskim Uniwersytecie Fryderyka Wilhelma, czyli obecnie Uniwersytecie Wrocławskim. Wykonywane przez niego rozdzielania można nazwać chromatografią kroplową. Runge jednak nie nazywał odkrytej przez siebie techniki rozdzielania chromatografią.

Zjawisko, które zaobserwował Runge, wykorzystał do identyfikacji składników mieszanin H. Schiff (1834–1915). Wykrywał on kwas moczowy na bibule nasyconej węglanem srebra. Dokładnie wykorzystanie reakcji na bibule opisał i zastosował w praktyce Ch.F. Schönbein (1799–1868). Stwierdził przy tym, że niektóre rozpuszczalniki tworzące mieszaninę mogą się na bibule rozdzielać. F. Goppelsröder (1837–1919) badał wpływ kapilar bibuły na zachodzące procesy rozdzielania. Stwierdził przy tym, że moryna jest dobrym odczynnikiem do wykrywania glinu. Od roku 1918 rozdzielanie anionów i kationów na bibule badał F. Feigl (1891–1971).

W procesach rozdzielania duże znaczenie ma prawo podziału Nernsta. Jest ono podstawowym prawem charakteryzującym proces rozdzielania chromatograficznego. Walther Nernst (1864–1941) urodził się w Wąbrzeźnie, w Prusach Wschodnich. Był profesorem w Lipsku, Heidelbergu, Berlinie i Göttingen. W 1920 r. otrzymał Nagrodę Nobla.

Za odkrywcę metody analitycznej, będącej początkiem współczesnej chromatografii, uważa się Michaiła Semenowicza Cwieta (1872–1919). Urodził się on we Włoszech, w Asti 14 maja 1872 r. Jego matka była Włoszką, a ojciec Ukraińcem pochodzącym z Czernichowa. W Związku Sowieckim twierdzono, że ojcem Michaiła był Rosjanin. Powtarzano to w wielu innych krajach bardzo długo, nawet po upadku Związku Sowieckiego.

Cwiet ukończył studia biologii, chemii i fizyki na uniwersytetach w Lozannie i w Genewie. W Lozannie został magistrem w 1893 r., a w Genewie, w roku 1898, otrzymał stopień doktora botaniki za badania komórek roślinnych. Jego rozprawa doktorska miała tytuł: Badanie fizjologii komórek. Materiały prowadzące do poznania ruchu protoplazmy, membran plazmowych i chloroplastów. W tym samym roku pojechał do Symferopola na Krymie, a następnie do Petersburga, gdzie ubiegał się o pracę w Rosyjskiej Akademii Nauk. Nie uznano jednak jego zagranicznych dyplomów. Dlatego, pomimo złej znajomości języka rosyjskiego, w 1901 r. obronił pracę dyplomową na Uniwersytecie w Kazaniu. Miała ona tytuł: Fizykochemiczne badanie ziaren chlorofilu. Doświadczenia i analiza.

W październiku 1901 r. Cwiet rozpoczął pracę w Zakładzie Anatomii i Fizjologii Roślin na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego. Był tam początkowo asystentem, a od 1902 r. – wykładowcą. W tym samym roku został członkiem Niemieckiego Towarzystwa Botanicznego. W 1907 r. Cwiet ożenił się z Polką, Heleną Trusewicz, która była nauczycielką w liceum w Siedlcach, a następnie bibliotekarką w Bibliotece UW. W latach 1908–1915 Cwiet pracował na Politechnice Warszawskiej jako starszy wykładowca botaniki i mikrobiologii. W 1910 r. obronił swoją drugą, tym razem rosyjską, pracę doktorską zatytułowaną Chromofile w świecie roślinnym i zwierzęcym. W 1911 r., za książkę opublikowaną w 1910 r. pt. Chromofile w roślinach i świecie zwierzęcym (w j. rosyjskim), otrzymał nagrodę Achmatowa w wysokości 1000 rubli.

Pierwsza wojna światowa, związana z wejściem Niemców do Warszawy w 1915 r., zastała Cwieta na urlopie w Odessie. Przez pewien czas był wykładowcą na Uniwersytecie w Juriewie, a 24 marca 1917 r. został kierownikiem Katedry Botaniki i Ogrodu Botanicznego Uniwersytetu w Tartu w Estonii, na stanowisku profesora. W wyniku rewolucyjnej sytuacji w ówczesnej Rosji Uniwersytet z Tartu został przeniesiony do Niżnego Nowogrodu i następnie do Woroneża, gdzie Cwiet zmarł 26 czerwca 1919 r. z powodu choroby serca i niedożywienia. Grób Cwieta znajduje się w Woroneżu, na cmentarzu na terenie żeńskiego klasztoru. Na grobowym pomniku znajduje się napis: Cwiet Michaił Semenowicz. 14.05.1872–6.06.1919. Otrzymał możliwość odkrycia chromatografii, która rozdziela cząsteczki i łączy ludzi.

Naukowo Cwiet zajmował się badaniem roślin. W tym celu sporządzał ekstrakty roślinne przy zastosowaniu eteru naftowego. Według prof. Sakodyńskiego, kiedyś przypadkowo wpadł Cwietowi do ekstraktu roślinnego kawałek kredy (CaCO₃), na którym, w jego części, pojawiła się pomarańczowa barwa składnika roztworu. Wykorzystując to zjawisko, Cwiet wypełnił szklaną rurkę sproszkowaną kredą i wlał do niej ekstrakt roślinny. Aby składniki ekstraktu przepływały przez warstwę kredy, dodawał kolejne porcje eteru naftowego lub benzenu. W wyniku tego składniki mieszaniny rozdzieliły się, czego objawem były barwne krążki na białym tle. Zwykle otrzymywał dwa krążki zielone na górze i pomarańczowe na dole. Górne zawierały chlorofil a i chlorofil b, a w dolnych były karotenoidy. Wyniki swoich prac Cwiet przedstawił na zebraniu sekcji biologicznej Warszawskiego Towarzystwa Nauk Przyrodniczych 21 marca 1903 r., prawdopodobnie o godz. 12.00. Jego referat miał tytuł O nowym zjawisku adsorpcji i jego zastosowaniu w analizie biochemicznej. Treść tego wykładu została opublikowana w czasopiśmie „Trudy Warshaw. Obszcz. Estestvoisp. Otd. Biol.” 14, 20–39 (1905).

Opracowaną przez siebie technikę rozdzielania barwnych składników mieszanin nazwał Cwiet chromatografią. Słowo chromatografia jest połączeniem greckich słów chroma – kolor i graphein – pisać. Dosłownie można więc przyjąć, że chromatografia jest zapisywaniem kolorów. W słowie chromatografia kryje się też nazwisko Cwieta ponieważ rosyjskie słowo cwiet oznacza kolor. Słowo chromatografia było używane w Wielkiej Brytanii, już w XIX wieku, w innym znaczeniu niż przez Cwieta. Obejmowało ono wtedy naukę o kolorach.

Wyniki swoich badań Cwiet opublikował w 1906 r. w pracy pt. Adsorptionanalyse und chromatographishe Methode Anvendung w czasopiśmie „Ber. Deutsch. Bot. Ges.” t. 25, s. 384–393 i w tym samym roku na s. 316–323 pracę pt. Physico-chemical studies of chlorophyll. The adsorption. W 26 tomie tego samego czasopisma, w 1907 r. na s. 71–74, opublikował polemiczną pracę: Historia badań chlorofilu. Odpowiedź Panu Marchlewskiemu. Ogółem rezultaty swoich badań Cwiet opisał w 62 publikacjach, wśród których dwie to książki. Tylko w jednej z tych publikacji nie był jedynym autorem. Były one publikowane w czasopismach o zasięgu międzynarodowym w języku niemieckim, francuskim i rosyjskim. 38 z tych publikacji było napisanych w Warszawie. Należy zwrócić uwagę na to, że odkrycie chromatografii przez Cwieta dotyczyło biochromatografii. Rozdzielone przez niego chlorofile i ksantofile są związkami chemicznymi biologicznie aktywnymi.

W uznaniu zasług Cwieta jako odkrywcy chromatografii, 13 września 1994 r., na ścianie gmachu Uniwersytetu Warszawskiego na Krakowskim Przedmieściu, w którym Cwiet pracował, odsłonięto tablicę pamiątkową. Na tablicy znajduje się następujący tekst: W tych murach, w latach 1901–1908 dr Michaił S. Cwiet (Tswett) odkrył chromatografię, Polscy chemicy analitycy.

Możliwość rozdzielenia chlorofili negował niesłusznie prof. Willstätter z Uniwersytetu w Monachium. Twierdził on, że chlorofil ulega rozkładowi podczas oddziaływania z sorbentem w kolumnie. Pogląd Willstättera został niestety przyjęty i dlatego odkrycie chromatografii było zapomniane przez około 25 lat. Dopiero w latach trzydziestych XX wieku zaczęto ponownie zajmować się rozdzielaniem składników mieszanin. W 1938 r. w ukraińskim Charkowie N.A. Izmaiłow i M.S. Szraiber odkryli chromatografię cienkowarstwową. Wykorzystali oni szklaną płytkę z naniesionym tlenkiem glinu do rozdzielania składników różnych mieszanin. Wyniki swoich prac opublikowali w 1938 r. w czasopiśmie „Farmatsiya”, nr. 3, s. 1–7, w artykule zatytułowanym Kroplowa chromatograficzna metoda analizy i jej zastosowanie w farmacji. W 1951 r. ukazała się praca Kirchnera, Millera i Kellera, a w 1956 i 1958 r. prace Stahla, które są podstawą współczesnej chromatografii cienkowarstwowej.

Podczas drugiej wojny światowej, w ramach projektu Manhattan, badano możliwość wykorzystania chromatografii jonowymiennej do rozdzielania pierwiastków ziem rzadkich i transuranowców w celu otrzymania materiału potrzebnego do konstrukcji bomby atomowej. Fazą stacjonarną w tych badaniach były pochodne polistyrenu. Mimo że izotopów uranu nie rozdzielono chromatograficznie, to zdobyto nowe informacje o istocie rozdzielania chromatograficznego, które umożliwiły szybki rozwój chromatografii po wojnie.

Jeszcze podczas wojny, w 1941 r. A.J.P. Martin i R.L.M. Synge opublikowali pracę, w której zwrócili uwagę na możliwość użycia gazu jako fazy ruchomej. Potwierdzili to w praktyce James i Martin, którzy w 1952 r. opisali zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania kwasów tłuszczowych. W 1955 r. zaoferowano pierwszy handlowy chromatograf gazowy z detektorem cieplno-przewodnościowym. Wtedy chromatografia gazowa została szeroko zastosowana do analizy substancji pochodzących z ropy naftowej. Obecnie za pomocą chromatografii gazowej analizuje się ok. 20 % wszystkich związków chemicznych o masach cząsteczkowych do ok. 1000 Da. Za pomocą pirolitycznej chromatografii gazowej możliwa jest analiza związków chemicznych o znacznie większych masach cząsteczkowych, w tym bakterii.

Równolegle ze wzrostem praktycznego wykorzystywania chromatografii coraz lepiej była poznawana jej teoria. W 1956 r. Van Deemter, Zuiderweg i Klinkerberg opublikowali pracę, w której opisali równanie znane obecnie jako równanie Van Deemtera. Jednocześnie szybko rozwijała się aparatura do chromatografii gazowej. W 1958 r. Golay zaproponował wykorzystanie w chromatografii gazowej kolumn kapilarnych. Jeszcze w latach 50. XX w. wprowadzono do użytku detektor płomieniowo-jonizacyjny, a następnie detektor wychwytu elektronów i połączono chromatograf gazowy ze spektrometrem mas. Zastosowanie mikrostrzykawek i programowania temperatury znacznie zwiększyło właściwości użytkowe chromatografii gazowej. W 1958 r. ukazała się praca Golaya, która zapoczątkowała stosowanie w chromatografii gazowej kolumn kapilarnych, najpierw stalowych, a potem szklanych i kwarcowych z immobilizowanymi fazami stacjonarnymi.

W 1965 r. J.C. Giddings opublikował pracę, która była początkiem wysokosprawnej chromatografii cieczowej. W 1966 r. podczas Międzynarodowego Sympozjum Chromatograficznego w Rzymie, a w następnym roku w opublikowanej pracy, Horvath, Preiss i Lipsky opisali rozdzielenie nukleotydów za pomocą tego rodzaju kolumnowej chromatografii cieczowej. W tym samym 1967 r. ukazały się prace Hubera i Hulsmana oraz Scotta i wsp., w których opisano zastosowanie tej chromatografii przy użyciu małych cząstek fazy stacjonarnej. Pierwsze chromatografy do wysokosprawnej chromatografii cieczowej zostały opisane w 1968 r. przez Halasza i wsp. oraz przez Kirklanda. Komercyjne chromatografy tego rodzaju zaoferowano w następnym roku.. W 1972 r. w chromatografii cieczowej zaczęto stosować chemicznie modyfikowane fazy stacjonarne o rozmiarach cząstek ok. 10 µm. Wprowadzenie do użytku niepolarnych faz stacjonarnych umożliwiło zastosowanie chromatografii w odwróconym układzie faz. W 1973 r. firma Merck zaproponowała do użytku w tej chromatografii sferyczne, a w 2000 r. monolityczne wypełnienia kolumnowe. Rozmiary cząstek faz stacjonarnych wynoszące 5–10 µm w 1975 r., zmniejszono do 3 µm w roku 1978 i do 1,5 µm w 1990 r. Jednocześnie zmniejszano średnice kolumn od 4,6 mm do 3 mm, 2,1 mm, a nawet 1 mm. W wyniku tego zużycie fazy ruchomej zmniejszyło się o 75 % i łatwiejsze stało się łączenie takich kolumn ze spektrometrami mas. Przy użyciu takich kolumn można też uzyskiwać lepsze wykrywalności i oznaczalności analitów. Pojawiły się kolumny z monolitycznymi fazami stacjonarnymi, mające pewne zalety w stosunku do kolumn z fazami stacjonarnymi w postaci cząstek. Oprócz faz stacjonarnych kulistych całkowicie porowatych wprowadzono fazy stacjonarne powierzchniowo porowate. Dostępne są kolumny, w których faza stacjonarna może oddziaływać z substancjami chromatografowanymi według różnych mechanizmów.

Dużym osiągnięciem było opracowanie generatora eluentu do chromatografii jonowej. Dzięki temu ten rodzaj chromatografii stał się łatwiejszy w użyciu, a jednocześnie uzyskano poprawę wykrywalności.

Powstała ultrasprawna chromatografia cieczowa, w której zastosowanie kolumn o długości 100 mm i krótszych umożliwiło otrzymywanie tak dobrego rozdzielenia jak w kolumnach o długości 250 mm, w znacznie krótszym czasie. Stało się to możliwe w wyniku znacznego zwiększenia sprawności kolumn i spłaszczenia wykresu Van Deemtera.

W latach dziewięćdziesiątych XX w. integralną częścią chromatografu stał się komputer. Umożliwiał on sterowanie pracą chromatografu, zbieranie danych i ich obróbkę oraz łączenie z chromatografami spektrometrów emisji atomowej, mas, ruchliwości jonów i pracujących w zakresie podczerwieni.

Chromatografia cienkowarstwowa stała się w pełni instrumentalną, wysokosprawną metodą analizy z automatycznymi aplikatorami próbek, nowego typu, w tym – poziomymi komorami i urządzeniami do rejestracji chromatogramów z możliwością zamiany chromatogramów plamkowych na pikowe.

W 2016 r. The Chromatographic Society sporządziło listę 10 najważniejszych osiągnięć w rozwoju chromatografii w ciągu 60. lat swojego istnienia i zapytało, jak oceniają je członkowie Towarzystwa. Wynik tego przedsięwzięcia przedstawia tabela 2.1.

TABELA 2.1. 10 największych osiągnięć w chromatografii w latach 1956–2016 z oceną ich znaczenia przez członków The Chromatographic Society

----------------------------------------------------------------- -------
Osiągnięcie Ocena

Pełna dwuwymiarowa chromatografia (LC i GC) 15,19

Sferyczne kulki żelu krzemionkowego bez metalu 16,46

Dwutłokowe pompy do LC i elucja gradientowa 24,05

Połączenie GC i LC ze spektrometrem mas 44,30

Rozdzielanie enancjomerów 7,59

Cząstki o wymiarach poniżej 2 µm i przyrządy do UHPLC 21,52

Kolumny kapilarne do GC 26,58

Powtarzalne pakowanie kolumn o średnicy 1 mm i mikroprzepływowe 0,00

systemy pompowe

Cząstki powierzchniowo porowate (core shell) 10,13

Sekwencjonowanie DNA za pomocą elektroforezy 20,25
----------------------------------------------------------------- -------

7,59 % członków Towarzystwa uznało, że ważne były inne osiągnięcia chromatografii.

Jeżeli pominie się wagi i pehametry, chromatografy są obecnie przyrządami najczęściej stosowanymi w laboratoriach na świecie. Jest to związane z tym, że istnieje zapotrzebowanie na analizy chromatograficzne w bardzo wielu dziedzinach związanych z życiem i działalnością ludzi. Wśród nich można wymienić np. analizy żywności i leków. W drugim z tych przypadków, należącym do biofarmacji, nie ograniczają się one do badania ich czystości, ale umożliwiają dobranie efektywnej, indywidualnej dawki leku poszczególnym pacjentom. W proteomice i metabolomice coraz większego znaczenia nabierają analizy prowadzone w skali mikro i nano.

Chromatograficznie prowadzi się kontrolę antydopingową sportowców, a także bada się procesy zachodzące w ciele sportowców podczas bardzo dużego wysiłku fizycznego. Duże znaczenie mają badania zanieczyszczeń środowiska, w tym specjalnych, np. bojowych, środków chemicznych. W kryminalistyce chromatograficznie wykrywa i identyfikuje się ślady umożliwiające znalezienie przestępcy. W powieściach kryminalnych dość często można spotkać opisy wykorzystania chromatografów do wykrycia przestępcy. Przeważnie jednak opisy te są błędne, np. w książce M.C. Smitha Park Gorkiego. Za pomocą chromatografii można wykrywać fałszerstwa dzieł sztuki. Chromatografię wykorzystuje się w badaniach kosmosu, np. do poznania składu chemicznego planet i ich księżyców, w tym do poszukiwania związków organicznych.

Wśród wielu zastosowań chromatografii, szczególnie cieczowej, do najważniejszych należą analizy związków chemicznych biologicznie aktywnych, np. w zakresie proteomiki, metabolomiki, metabonomiki, lipidomiki i innych nauk omicznych. Ważne są przy tym możliwości diagnozy chorób oraz poznawanie mechanizmów wywołujących choroby. Nowe możliwości w tym zakresie są związane z wprowadzeniem do użytku kolumn monolitycznych i matrycowych. W badaniach bioanalitycznych, biochemicznych i biotechnologicznych szczególne znaczenie ma połączenie chromatografii ze spektrometrią mas i spektrometrią ruchliwości jonów. W latach 2010–2020 nastąpił bardzo duży postęp w chromatograficznej analizie biomateriałów zawierających białka, peptydy, kwasy nukleinowe, oligonukleotydy, glikany i lipidy.

Przewiduje się, że dalszy rozwój chromatografii będzie związany z miniaturyzacją aparatury, zmniejszaniem zużycia faz ruchomych i skróceniem czasu rozdzielania. Jest to związane z dążeniem do obniżenia kosztów analiz i zmniejszenia ich wpływu na środowisko. Przyrządy do szybkiej wielowymiarowej chromatografii gazowej i cieczowej będą prostsze w użyciu i przystosowane do rutynowych analiz. W przypadku pełnej chromatografii dwuwymiarowej programy do interpretacji chromatogramów będą prostsze i bardziej przyjazne. Urządzenia do przygotowania próbek będą automatyzowane i integrowane z przyrządami analitycznymi. Doskonalone będą detektory i wzrośnie znaczenie przyrządów hybrydowych. Prawdopodobnie zwiększy się rola przyrządów przeznaczonych do wykonywania określonych analiz wyposażonych w detektory i programy komputerowe specyficzne do tych analiz. Jest oczekiwanie, że pojawią się przenośne chromatografy cieczowe.

Chromatografia w Polsce

Odkryta na początku XX wieku w Warszawie, chromatografia zaczęła istnieć i rozwijać się w po II wojnie światowej, przede wszystkim w Lublinie i Krakowie. W Krakowie zainteresował się nią prof. Jan Głogoczowski w Instytucie Naftowym, gdzie wykorzystywał chromatografię gazową w analizach produktów petrochemicznych. Prowadził też kursy chromatografii. W 1954 r. w Krakowie odbyło się Kolokwium Chromatograficzne, a w 1961 r. Pierwsza Krajowa Konferencja Chromatografii Gazowej. W 1957 r. ukazała się książka pt. Chromatografia, której autorami byli: J. Opieńska-Blaut, A. Waksmundzki i M. Kański. Mniej więcej w tym samym czasie co w Krakowie powstał silny ośrodek chromatograficzny w Lublinie. Osiągnięcia tego ośrodka były tak duże, że promieniował na całą Polskę i uzyskał określenie Lubelska Szkoła Chromatografii. Było to zasługą prof. Waksmundzkiego i jego zespołu, w skład którego wchodził m.in. prof. Zdzisław Suprynowicz. Obaj byli nie tylko wielkimi chromatografistami, ale także zapalonymi wędkarzami z dużymi sukcesami także w tej dziedzinie.

Prof. Waksmundzki jako członek ruchu oporu podczas II wojny światowej był więźniem w fabryce chemicznej. W tej fabryce mieszczącej się w Dyrhenfurth, (obecnie Brzeg Dolny) Niemcy produkowali tabun – fosforoorganiczny bojowy środek trujący. Profesor był świadkiem tego jak Niemcy kontrolowali jakość wytwarzanej amunicji chemicznej. Partię wytworzonej amunicji umieszczali w hermetycznie zamykanym pomieszczeniu razem z kilkoma więźniami na noc. Rano sprawdzali czy więźniowie przeżyli. Jeżeli przeżyli, amunicja była dobra. Jeżeli nie przeżyli, amunicja była nieszczelna – więźniowie umierali w wyniku zatrucia tabunem. Życie i osiągnięcia prof. Waksmundzkiego zostały opisane w książce Pitagoras z Waksmunda oraz w wydanej w 2024 r. książce autorstwa córki Profesora – Moniki Waksmundzkiej-Hajnos p.t. Waks i przyjaciele. Przydomek Pitagoras został nadany Profesorowi przez ks. prof. Józefa Tischnera w jego książce Historia filozofii po góralsku.

Badania chromatografii i przy użyciu chromatografii były prowadzone w Lublinie w Akademii Medycznej i na Uniwersytecie Marii Curie-Skłodowskiej. W Akademii Medycznej w rozwoju chromatografii cieczowej duże zasługi miał prof. Edward Soczewiński, uczeń prof. Waksmundzkiego. W światowej literaturze naukowej istnieją równania Soczewińskiego–Wachtmeistera i Snydera–Soczewińskiego opisujące zjawiska fizykochemiczne występujące w rozdzielaniu chromatograficznym. Prof. Soczewński był znanym kolekcjonerem medali. Obecnie na Uniwersytecie Medycznym w Lublinie badania dotyczące chromatografii i jej zastosowań kontynuuje córka prof. Waksmundzkiego – prof. Monika Waksmundzka-Hajnos.

W rozwoju chromatografii znaczny udział mieli naukowcy z Politechniki Gdańskiej i Akademii Medycznej w Gdańsku. W PG byli to profesorowie Jerzy Kowalczyk, Andrzej Stołyhwo i Rafał Staszewski, a w Akademii Medycznej – prof. Roman Kaliszan.

Na Uniwersytecie Warszawskim chromatografią zainteresował się wybitny fizykochemik i analityk elektrochemik, prof. Wiktor Kemula. Był on prekursorem łączenia chromatografii z innymi technikami analitycznymi – stworzył chromatopolarografię. Z jego inicjatywy, jako przewodniczącego Komitetu Chemii Analitycznej PAN, powołano Komisję Analizy Chromatograficznej. Jej pierwszym przewodniczącym był prof. A. Waksmundzki, następnie prof. E. Soczewiński i prof. Z. Witkiewicz. Komisja została przekształcona w Zespół Analizy Chromatograficznej i Technik Pokrewnych, a jego przewodniczącym jest prof. B. Buszewski.

Chromatografia w Polsce rozwijała się i nadal się rozwija w wielu ośrodkach akademickich. Dotyczy to tak badań podstawowych związanych z teorią chromatografii, jak i jej wykorzystania w praktyce. Badania dotyczą wszystkich rodzajów chromatografii – gazowej cieczowej kolumnowej i cienkowarstwowej – w zastosowaniach analitycznych, a w przypadku chromatografii gazowej także w zastosowaniach fizykochemicznych. Szczegółowo osiągnięcia polskich chromatografistów opisał prof. B. Buszewski w artykule opublikowanym w czasopiśmie „Separations”, 9 (2022) 50.

Wyrazem uznania za osiągnięcia w dziedzinie chromatografii jest przyznawanie przez Komitet Chemii Analitycznej PAN raz w roku jednemu naukowcowi polskiemu i jednemu zagranicznemu Medalu Waksmundzkiego. Do 2023 r. medal ten otrzymało 26 Polaków. Chromatografiści z Polski i innych krajów są także nagradzani za swoją działalność medalem Central European Group for Separation Sciences (CEGSS). Nagrodę tę otrzymało już kilku Polaków, prof. Bogusław Buszewski, prof. Renata Gadzała-Kopciuch, prof. Joanna Kałużna-Czaplińska, prof. Rafał Głowacki i prof. Zygfryd Witkiewicz. W 2024 r. na łamach czasopisma „Separations” ukazał się artykuł przedstawiający historię, powstanie CEGSS oraz informacje o działalności tej międzynarodowej grupy chromatografistów.

Spojrzenie w przyszłość

W dniach 25–28 czerwca 2023 r., podczas XIII Konferencji Chromatograficznej w Katowicach, odbyła się debata na temat przyszłości metod rozdzielania. Problem ten jest czasem rozważany w literaturze i przez zainteresowanych rozwojem chromatografii. Zajmuje się nim m.in. The Chromatographic Society (ChromSoc) przy okazji kolejnych rocznic jego istnienia. Wypowiadają się w tej sprawie chromatografiści naukowcy i użytkownicy aparatury chromatograficznej oraz projektanci, konstruktorzy i producenci tej aparatury. Śledząc wypowiedzi w tej dziedzinie, można stwierdzić, że przewidywania rzadko się spełniają. Przekonał się o tym prof. Peter Myers z Uniwersytetu w Liverpool, który z okazji złotego jubileuszu ChromSoc starał się przewidzieć, co w zakresie chromatografii zdarzy się w następnych latach. Po dziesięciu latach ocenił co z jego przewidywań się sprawdziło. (P. Myers, „The future revisited”, LC GC Europe, 29 (2016) 42). Sprawdziło się to, że jak przewidywał kolumny monolityczne i cząstki faz stacjonarnych o rozmiarach poniżej 2 µm nie uzyskały takiego znaczenia jakie im wróżono. Nie sprawdziło się natomiast przewidywanie Myersa dotyczące nowych lepszych systemów dozowania próbek i detektorów do HPLC. Pomylił się także, przewidując rozwój inteligentnych kolumn. Taka kolumna miałaby zawierać nie tylko informację o fazie stacjonarnej, ale także o jej właściwościach, procedurach możliwych do wykonania przy użyciu kolumny oraz o potrzebie jej wymiany. Prof. Myers błędnie przewidział zmianę wywoływania przepływu fazy ruchomej. Zamiast tradycyjnych pomp postulował stosowanie układów pompowania nanomechanicznego do przepływu elektroosmotycznego.

Uczestnicy wspomnianej powyżej debaty nie zgodzili się z pojawiającymi się czasem głosami, że era dużego znaczenia chromatografii w analizie chemicznej dobiega końca. Ma tak być podobno dlatego, że bardzo wzrasta znaczenie spektrometrii mas. Jest zgoda co do dużego znaczenia spektrometrii mas i coraz większego znaczenia spektrometrii ruchliwości jonów, ale głównie w połączeniu z różnymi rodzajami chromatografii.

Znacznie łatwiejsze niż prorokowanie tego, co będzie w przyszłości z rozwojem i znaczeniem chromatografii, jest formułowanie oczekiwań dotyczących tego, co powinno być. Analitycy wykorzystujący w swojej działalności poszczególne techniki rozdzielcze widzą pewne potrzeby, których zaspokojenie ułatwiłoby im pracę. Rozwój aparatury chromatograficznej i procedur analitycznych jest na takim poziomie, że trudno oczekiwać jakiegoś przełomowego, rewolucyjnego odkrycia. Bardziej prawdopodobna jest stopniowa ewolucja i doskonalenie tego, co znamy, a co powinno i może być lepsze. Dobrze byłoby gdyby nastąpiło dalsze zwiększenie mobilności aparatury chromatograficznej. W tej dziedzinie przoduje chromatografia gazowa. Dalszy rozwój mobilnych chromatografów gazowych mógłby polegać na ich miniaturyzacji i automatyzacji działania, tak aby mogły one spełniać rolę monitorów. Powinny one mieć możliwość długotrwałej pracy bezobsługowej z możliwością bezprzewodowego przekazywania wyników swojego działania na odległość. Takie przyrządy w większym niż obecnie stopniu powinny być wyposażane w detektory czujnikowe i spektrometry ruchliwości jonów. Konstrukcja takich hybrydowych przyrządów powinna być maksymalnie uproszczona i możliwa do wykorzystania w każdych warunkach atmosferycznych.

Dużo do zrobienia w przyszłości jest w zakresie mobilnych chromatografów cieczowych i elektroforegrafów kapilarnych. Dotychczasowe próby dotyczące konstrukcji i wykorzystania takich przyrządów w warunkach polowych są obiecujące, ale wymagają dalszych intensywnych prac, aby chociaż w części mogły mieć takie zastosowanie jak mobilne chromatografy gazowe. Chromatografy cieczowe powinny być kompaktowe i zużywać mniej energii i rozpuszczalników organicznych. Dużo w tym zakresie dokonuje się w związku z wprowadzaniem coraz większej liczby krótkich kolumn o małych średnicach.

Programy komputerowe we wszystkich rodzajach chromatografów, a szczególnie dwuwymiarowych (GC × GC i LC × LC) oraz szybkich, powinny być bardziej intuicyjne, na tyle proste w obsłudze, żeby mogli z nich korzystać analitycy bez wysokospecjalistycznego przygotowania.

Jednym z ważnych kierunków zmian w chromatografii jest odchodzenie od helu i zastępowanie go innymi gazami nośnymi, szczególnie wodorem w chromatografii gazowej. Hel jest coraz droższy i coraz trudniej dostępny. Przewiduje się, że w końcu obecnego wieku helu na Ziemi nie będzie. Przyczyną tego jest jego ulatnianie się w przestrzeń kosmiczną.

W chemii analitycznej, podobnie jak w innych dziedzinach chemii, dużo uwagi poświęca się dążeniu do zmniejszenia jej wpływu na środowisko. Dąży się do tego, żeby analiza chemiczna była jak najbardziej zielona. Należy przy tym uwzględnić to, że chromatografia jest metodą analityczną, która może wywierać niekorzystny wpływ na środowisko. Szczególnie dotyczy to chromatografii cieczowej. Dlatego jednym z kierunków rozwoju chromatografii jest czynienie jej coraz bardziej zieloną.

Najbardziej rozwijanym kierunkiem chromatografii jest zbiór jej technik i procedur do analizy substancji biologicznie aktywnych. Szczególnie szybki rozwój w tej dziedzinie wiedzy nastąpił na początku lat dwudziestych obecnego wieku w związku z pandemią COVID-19.