Diagnostyka bakteriologiczna - ebook

PRZEDMOWA

W ostatnich latach rozwój mikrobiologii jako dziedziny naukowej gwałtownie przyspieszył. Dzięki postępowi w technikach wykrywania określonych sekwencji DNA możliwa stała się analiza metagenomiczna populacji drobnoustrojów obecnych w różnych środowiskach. Przyniosła ona zaskakujące, inspirujące wyniki. Dla mikrobiologii klinicznej kamieniem milowym stał się zapoczątkowany w 2007 roku Human Microbiome Project, który wyzwolił serię badań angażujących kolejne zaawansowane metody. Po wykazaniu niespodziewanej różnorodności drobnoustrojów bytujących w organizmie człowieka przyszła kolej na dokładną analizę ich materiału genetycznego. W innych etapach tych badań oceniana jest różnorodność produktów transkrypcji genów i oddziaływanie metabolitów mikroorganizmów na fizjologię człowieka w zdrowiu i chorobie. Powiązanie składu mikrobiomu jelitowego z występowaniem chorób nieinfekcyjnych było przykładem zupełnie nowego spojrzenia na tworzące go bakterie. Jednocześnie łączenie składu i poznanie proporcji drobnoustrojów stanowiących mikrobiom różnych miejsc i układów z chorobami infekcyjnymi stanowi duże wyzwanie dla diagnostyki mikrobiologicznej. Wymaga ono nowego spojrzenia na jej cele i obecnie otrzymywane wyniki laboratoryjne. Wszystko to spowodowało konieczność przygotowania kolejnego wydania Diagnostyki bakteriologicznej.

Oddane do rąk czytelników wydanie zachowało pierwotną konstrukcję książki. Wszystkie rozdziały zostały jednak uaktualnione, co niekiedy wymagało napisania ich niemal od nowa. Do grona dotychczasowych autorów dołączyły Ewa Augustynowicz-Kopeć i Alina M. Olender, znane ekspertki w tematach, które opracowały. Powstał też oczekiwany przez czytelników nowy rozdział poświęcony problemowi lekooporności, którego autorką jest osoba najbardziej kompetentna w tej dziedzinie w Polsce – Waleria Hryniewicz.

Pierwszy rozdział książki poświęcony jest zasadom współczesnej taksonomii, ale także konieczności nowego podejścia do diagnostyki zakażeń. Kolejne rozdziały systematycznej części książki opisują poszczególne grupy drobnoustrojów. Utworzono je na podstawie pokrewieństwa filogetycznego, ale niekiedy uwzględniono w nich także rodzaje podobne fenotypowo, co zmusza do odróżniania ich w materiałach klinicznych od innych, omówionych w rozdziale. Opisy pokazują szereg cech tych bakterii, od patogenezy zakażeń, aż po szczegóły pozwalające na prawidłowe różnicowanie. Materiał zawarty w książce dostarcza wiedzy często wykraczającej poza ramy danych niezbędnych obecnie do wykonywania rutynowej diagnostyki. Mamy nadzieje, że może stanowić źródło nowych rozwiązań i postępowań.

W tym wydaniu książki nie ma rozdziału „Fizjologiczna flora człowieka”. Zastąpił go rozdział 22 „Bakterie w organizmie zdrowego człowieka” i warto się z nim zapoznać nawet na samym początku lektury. Zmienił się bowiem nie tylko sposób nazywania drobnoustrojów bytujących w organizmie człowieka, ale pojawił się również nowy paradygmat oceny ich znaczenia dla zdrowia i choroby. W dalszych rozdziałach części diagnostycznej przedstawiono znaczenie najnowszych odkryć w dziedzinie badania mikrobiomu w obrębie poszczególnych układów. Znacznym zmianom uległ rozdział 38 omawiający metody molekularne stosowane w diagnostyce i dochodzeniach epidemiologicznych. Pojawił się też nowy, nieobecny w poprzednich wydaniach rozdział 39 mówiący o problemach lekooporności w diagnostyce i terapii.

W książce, obok gatunków dobrze znanych, opisano wiele dotychczas nieznanych, których obecność i znaczenie dla stabilności mikrobiomu lub dysbiozy stały się jasne dopiero wtedy, gdy je wielokrotnie wykrywano w jego składzie. Wymieniono szereg drobnoustrojów, które dopiero w ostatnich dwóch-trzech latach pojawiły się w bazie LPSN (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature) i których znaczenia dla patologii człowieka często nie jesteśmy jeszcze w stanie dokładnie ocenić. Niektóre powszechnie znane bakterie zmieniły nazwę lub umiejscowienie w klasyfikacji. Należy jednak podkreślić, że nadal nie ma takiej klasyfikacji bakterii, która byłaby powszechnie uznana. Podstawą do ich grupowania są przede wszystkim związki filogenetyczne, które zostały ustalone w ostatnim okresie, oraz wyniki badań publikowane w International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology i innych znaczących czasopismach. Zmiany w taksonomii towarzyszą nam nieustannie, a wspomniana baza była źródłem najbardziej aktualnej wiedzy wykorzystanej w tej książce.

Ogromna zmienność bakterii sprawia, że w dziedzinie mikrobiologii musimy być gotowi na nowości i stale poszerzać i korygować wcześniej zdobytą wiedzę. Mamy nadzieję, że nasza książka będzie w tym pomocna.

Pragniemy podziękować redaktorom Wydawnictwa Naukowego PWN SA za stworzenie możliwości uaktualnienia wydania z 2013 roku. Szczególne podziękowania należą się pani Krystynie Kruczyńskiej, która tak teraz, jak i przy poprzednich wydaniach niestrudzenie nas wspierała swoim doświadczeniem redaktora merytorycznego. Tym razem o pierwszą lekturę książki poprosiliśmy studentów. Bardzo dziękujemy Magdalenie Rozwens, która okiem młodego diagnosty wnikliwie spojrzała na nasze teksty i wiele do nich wniosła. Dziękujemy gorąco też wszystkim, którzy podejmując z nami rozmowy i dyskusje, przyczynili się do ostatecznego kształtu tej książki, a także pomogli połączyć zawartą w niej wiedzę teoretyczną z praktyką diagnostyki laboratoryjnej.

Eligia M. SzewczykINTERPRETACJA TABEL

Autorzy unikali wprowadzania do tabel cech niejednoznacznych lub słabo różnicujących. Dane zawarte we wszystkich tabelach należy odczytywać w taki sam, wskazany niżej sposób.

+

oznacza reakcję dodatnią występującą u 90% lub większej liczby szczepów opisywanego gatunku czy rodzaju

–

oznacza reakcję ujemną występującą u 90% lub większej liczby szczepów

+/–

oznacza reakcję dodatnią u 51–89% szczepów danego gatunku

–/+

oznacza reakcję ujemną u 51–89% szczepów danego gatunku

V

oznacza reakcję zmienną, np. różną u różnych gatunków rodzaju lub szczepów gatunku

Wrażliwy

oznacza wrażliwość na wskazaną w tabeli substancję zgodnie z kryterium opisanym w tekście lub Aneksie

Oporny

oznacza oporność na wskazaną w tabeli substancję zgodnie z kryterium opisanym w tekście lub Aneksie

BD

brak danych

Niektóre tabele zaopatrzone są w dodatkowe, specyficzne dla siebie legendy.WYBRANE SKRÓTY

AmpC – mechanizm oporności wynikającej z wytwarzania cefalosporynaz kodowanych chromosomowo

BCG – Bacillus Calmette–Guérin – szczep szczepionkowy prątków gruźlicy

BSL (ang. biosafety level) – stopień bezpieczeństwa biologicznego, laboratoria dostosowane do pracy z patogenami grup ryzyka

BV (ang. bacterial vaginosis) – waginoza bakteryjna

CDC (ang. Centers for Disease Control and Prevention) – Centrum Kontroli i Prewencji Chorób USA

CFU (ang. colony forming unit) – jednostka tworząca kolonię, zwykle jedna komórka lub przetrwalnik, ale także grupa, która nie rozdzieliła się po podziale (dwoinka, łańcuszek)

CLSI (ang. Clinical Laboratory and Standards Institute) – amerykański Instytut Norm Klinicznych i Labotatoryjnych

CPE (ang. carbapenemase producing Enterobacteriaceae) – pałeczki jelitowe wytwarzające karbapenemazy

CRP (ang. C-reactive protein) – białko C-reaktywne

CSI (ang. conserved signature insertions/deletions) – konserwatywne molekularne markery (insercje bądź delecje) wskazujące na pokrewieństwo filogenetyczne

ECDC (ang. European Centre for Disease Prevention and Control) – Europejskie Centrum ds. Zapobiegania i Kontroli Chorób

ECM (ang. extracellular matrix) – białka zewnątrzkomórkowej macierzy gospodarza

ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) – test immunoenzymatyczny

EN – normy europejskie

ESβL (ang. extendet spectrum β-lactamase) – β-laktamazy o poszerzonym zakresie działania

EUCAST (ang. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) – komitet europejski oceny wrażliwości drobnoustrojów

GALT (ang. gastrointestinal-associated lymphoid tissue) – tkanka limfatyczna związana z układem pokarmowym

GAS (ang. group A streptococci – S. pyogenes) – paciorkowce należące do grupy serologicznej A

GBS (ang. group B streptococci – S. agalactiae) – paciorkowce należące do grupy serologicznej B

GLC (ang. gas-liquid chromatography) – chromatografia gazowo-cieczowa

GNAC (ang. gram-negative anaerobic cocci) – beztlenowe ziarenkowce gramujemne

GPAC (ang. gram-positive anaerobic cocci) – beztlenowe ziarenkowce gramdodatnie

HACEK – grupa rodzajów bakterii (Haemophilus, Aggregatibacter, Cardiobacterium, Eikenella i Kingella), które mogą być przyczyną infekcyjnego zapalenia wsierdzia

HGT (ang. horizontal gene transfer) – horyzontalne przekazywanie genów

HLAR (ang. high level aminoglycoside resistance) – oporność wysokiego stopnia na aminoglikozydy

HMP (ang. Human Microbiome Project) – projekt badania ludzkiego mikrobiomu

HSP (ang. heat shock proteins) – białka szoku termicznego

IFA (ang. indirect immunofluorescence assay) – immunofluorescencja pośrednia

IS (ang. insertion sequence) – sekwencje insercyjne

ISO (ang. International Organization for Standardization) międzynarodowa organizacja normalizacyjna

KDO – kwas 2-keto-3-deoksyoktonowy

KORLD – Krajowy Ośrodek Referencyjny Lekooporności Drobnoustrojów

KRLP – Krajowe Referencyjne Laboratorium Prątka

LOS – lipooligosacharyd, składnik ściany komórkowej niektórych bakterii gramujemnych

LPS – lipopolisacharyd

LPSN (ang. List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature) – lista nazw drobnoustrojów wskazująca ich lokalizację w systemie klasyfikacyjnym (http://bacterio.net – strona internetowa ufundowana przez J.P. Euzeby’ego)

MALDI-TOF MS (ang. matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) – desorpcja/jonizacja laserem wspomagana matrycą z pomiarem czasu przelotu jonów i spektrometrią mas

MALT (ang. mucose-associated lymphoid tissue) – tkanka limfatyczna związana z błonami śluzowymi

MLS_(B) (oporność) (ang. macrolide, lincosamide, streptogramine B resistance) – mechanizm oporności krzyżowej na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B

MIC (ang. minimal inhibitory concentration) – najmniejsze stężenie hamujące wzrost drobnoustrojów

MDR (ang. multidrug resistance) – oporność na wiele antybiotyków

MLST (ang. multi-locus sequence typing) – analiza sekwencji wielu genów

MRSA (ang. methicillin resistant S. aureus) – Staphylococcus aureus oporne na meticylinę

NAAT (ang. nucleic acid amplification test) – metoda diagnostyczna oparta na amplifikacji kwasów nukleinowych

nested-PCR – gniazdowa (zagnieżdżona) łańcuchowa reakcja polimerazy

NGS (ang. next-generation genome sequencing) – sekwencjonowanie nowej generacji

OB – odczyn Biernackiego

OIT – oddział intensywnej terapii

OMP (ang. outer membrane proteins) – białka błony zewnętrznej bakterii

OUN – ośrodkowy układ nerwowy

OWD – odczyn wiązania dopełniacza

PAI (ang. pathogenicity islands) – genomowe wyspy patogenności

PBP (ang. penicillin binding proteins) – białka wiążące penicyliny

PCT – prokalcytonina

POChP – przewlekła obturacyjna choroba płuc

REA-PFGE (ang. restriction enzyme analysis with pulsem field gel electrophoresis) – analiza restrykcyjna z elektroforezą w zmiennym polu elektrycznym

real-time PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy w czasie rzeczywistym

RFLP (ang. restriction fragment length polymorphism) polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

RPLA (ang. reverse passive latex agglutination) – test biernej aglutynacji lateksowej

RT-PCR (ang. reverse transcription-PCR) – łańcuchowa reakcja polimerazy z odwrotną transkrypcją

SCFA (ang. short chain fatty acids) – krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe

SLST (ang. single-locus sequence typing) – analiza sekwencji pojedynczych genów

SOR – szpitalny oddział ratunkowy

STI (ang. sexual transmited infection) – infekcje przekazywane drogą płciową

TORCH – grupa drobnoustrojów odpowiedzialnych za infekcje wewnątrzmaciczne i okołoporodowe (toksoplazmoza, różyczka, cytomegalia, zakażenie wirusem opryszczki pospolitej i inne)

VISA (ang. vancomycin intermediate resistant Staphylococcus aureus) – szczepy S. aureus o zmniejszonej wrażliwości na wankomycynę (średnio wrażliwe); hVISA (ang. heterogenous VISA) – o heterogennej oporności

WGS (ang. whole genome sequencing) – sekwencjonowanie pełnogenomowe

WHO (ang. World Health Organization) – Światowa Organizacja Zdrowia1 EWOLUCJA, TAKSONOMIA, DIAGNOSTYKA Eligia M. Szewczyk

Genom mikroorganizmów składa się z genów, które ulegają ewolucyjnym zmianom wynikającym z wymiany czy utraty lub pozyskania nowych sekwencji. Zawarte w nich informacje przekładają się na dziesiątki i setki cech wynikających z ekspresji kodowanych białek lub cząsteczek regulujących. Ewolucja dokonuje się dzięki dwóm podstawowym procesom: zmienności i selekcji. Zmienność dotyczy zawartego w komórkach DNA, a selekcja wybiera te cechy lub komórki, w których powstałe zmiany genotypu przyniosły korzystne w warunkach środowiskowych zmiany fenotypu.

Cechy wszystkich organizmów w dużej mierze są odbiciem struktury ich genomów i już za czasów Linneusza pozwalały na tworzenie porządkujących je systemów opartych na ich zewnętrznym podobieństwie, mających jednak źródło w ich wspólnym ewolucyjnym pochodzeniu. Z racji zastosowanych wtedy metod obarczone były one licznymi błędami. Współczesny system korzysta z narzędzi genetycznych, które pozwalają budować najbardziej wierne drzewa pokrewieństw, wywodzące współczesne organizmy od wspólnego przodka.

Zmienność genetyczna bakterii jest warunkowana procesami horyzontalnej wymiany genów (HGT – ang. horizontal gene transfer), transpozycją i mutacjami. Zmiany w DNA bakterii są na ogół łatwo zauważalne. Mogą to być jednak także drobne zmiany sekwencji nukleotydów, które gromadzą się w przebiegu ewolucji. Zmiany te, nie mając wpływu na ekspresję cech, stanowią informację dla taksonomów chcących ustalić pokrewieństwo między obecnie żyjącymi organizmami i wykazać dywergencję poszczególnych grup i gatunków w przebiegu ewolucji.

Przebieg lub raczej konsekwencje ewolucji odzwierciedlają drzewa podobieństw pokazujące filogenezę poszczególnych taksonów. Przełomem w badaniach pokrewieństwa prokariotów, ale i wszystkich organizmów żywych stało się porównywanie sekwencji małej podjednostki rybosomowego RNA (SSU – ang. small ribosomal subunit). W przypadku komórek prokatiotycznych jest to cząstka o stałej sedymentacji 16S pochodząca z podjednostki (30S) ich rybosomów. Takie rybosomy można jednak też znaleźć w plastydach roślin i mitochondriach zwierzęcych. Marker ten i jego funkcjonalny odpowiednik 18S rRNA rybosomów komórek eukariotycznych stanowią obecnie podstawowy znacznik ewolucji wspólny dla całego świata istot żywych. Znaczenie sekwencji SSU jako elementu wyznaczającego pokrewieństwo wynika przede wszystkim z jego bardzo powolnych ewolucyjnie przeobrażeń. Większość zmian w tej cząsteczce powstających na drodze mutacji uszkadza ją i eliminuje, a tylko nieliczne zachowują się, stanowiąc piętno istotne dla badań porównawczych. Sekwencje nukleotydów rRNA określa się jako skrajnie konserwatywne. Dla badań filogenetycznych jest to bardzo pożyteczna cecha. Można ją wykorzystać do konstruowania historii związków ewolucyjnych, gdyż zmiany w długim okresie zachodzą w możliwych do przewidzenia odstępach. Dlatego rRNA określa się mianem zegara molekularnego lub filogenetycznego chronometru. Badania filogenetyczne oparte na wynikach uzyskanych z użyciem tego nowego narzędzia stały się podstawą zasadniczych zmian w taksonomii organizmów. W 1977 roku na jego podstawie Woese i Fox wskazali na filogenetyczną odrębność prokariotycznych Archaea. Konsekwencją tego odkrycia była zmiana taksonomii na jej najwyższych piętrach. Zaproponowano utworzenie trzech domen: Archaea – obejmującej różne od bakterii właściwych organizmy prokariotyczne, Bacteria – bakterie właściwe i Eucarya obejmujące wszystkie organizmy zawierające w komórkach jądro. Podział ten stał się podstawą nowego spojrzenia na ewolucję, a w ślad za tym taksonomię, także taksonomię bakterii.

Podstawą taksonomii filogenetycznej stała się zatem struktura 16S rRNA, którego chromosomowym odpowiednikiem jest rDNA. Na podstawie tych sekwencji oraz świadczących o pokrewieństwie wyjątkowych polimorfizmów typu insercji lub delecji – CSI (ang. conserved signature insertions/deletions) zasugerowano drogę ewolucyjną poszczególnych współczesnych grup drobnoustrojów. Rodzaj wydzielonych grup i kolejność ich oddzielania się od pnia przodka przedstawiono schematycznie w tabeli 1.1. Pokazuje ona, że najdawniej, zaraz po Archaea wyodrębnioną grupą, a zatem grupą ewolucyjnie bardzo starą, są bakterie gramdodatnie o małej zawartości guaniny i cytozyny w DNA (G + C mol%): Firmicutes, a wśród nich ważne w mikrobiologii medycznej rodzaje: Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium i wiele innych. Nieco młodsze są bakterie gramdodatnie o dużej zawartości G + C (Actinobacteria). Po wyodrębnieniu Spirochaetes przyszła dopiero kolej na wielką grupę pałeczek gramujemnych, a wśród nich beztlenowe Bacteroides czy Prevotella w obrębie Bacteroidetes. Filogenetycznie najmłodsze są Proteobacteria, obejmujące między innymi γ-Proteobacteria, do których zaliczane są na przykład pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae i wiele innych pałeczek, często izolowanych od ludzi.

Tabela 1.1. Dywergencja grup drobnoustrojów w przebiegu ewolucji (wg Gupty i wsp.)

Taksonomia prokariotów jako dyscyplina zbierająca dane dotyczące klasyfikacji, nomenklatury i opisu tej grupy organizmów jest dziedziną otwartą. Nie ma przyjętego oficjalnego systemu, którym należałoby się kierować, a tworzone listy są wypadkową licznych danych bioinformatycznych. Uzgodniono jednak, że podstawą obecnej taksonomii są sekwencje SSU. Nowe techniki badawcze przynoszą rocznie wiele setek tysięcy nowych sekwencji tego fragmentu. Liczba zdeponowanych w bazach danych SSU organizmów prokariotycznych przekroczyła już cztery miliony i przyrasta w sposób logarytmiczny. Napływ nowych danych tworzy problemy, do których należy ich wiarygodność i znaczenie dla badania filogenezy i tworzenia taksonomii. Największą wartość mają sekwencje o długości większej niż 1400 nukleotydów, w których udział dwuznacznych miejsc byłby mniejszy niż 4%, a brakujących pozycji nie byłoby więcej niż 10, gdyż poziom konserwatywności tego fragmentu jest różny w różnych jego regionach. Jednak zaledwie 23% zdeponowanych sekwencji SSU jest dłuższych niż 900 bp.

Podkreśla się, że opisy taksonomiczne muszą obejmować wysokiej jakości sekwencje SSU, ale też sekwencje pełnego genomu, obejmujące nie mniej niż 99% jego długości, określone najwyżej w kilku segmentach. Podstawą rekonstrukcji genealogicznych muszą być zestawy genów konserwatywnych w obu tych źródłach. Liczba poznanych sekwencji genomów prokariotycznych przekroczyła już wprawdzie 150 tysięcy, ale w większości są one zaledwie częściowe. Niemniej daje to pole dla systemów bioinformatycznych wyszukujących podobieństwa i różnice. Badania takie pozwalają znajdować inne niż rDNA konserwatywne fragmenty, które można wykorzystywać do ustalania zależności między organizmami na różnych poziomach taksonomicznych. Większe zróżnicowanie genetyczne badanego genu czy fragmentu (mniejsza konserwatywność) stwarza możliwość wykorzystania go na niższym poziomie taksonomicznym. Sekwencje, które okazały się szczególnie przydatne, to odcinki międzygenowe, pseudogeny oraz geny kodujące niektóre białka komórkowe, które w procesie ewolucji szybciej niż rDNA ulegały zmianom. Niektóre z nich wymieniono w tabeli 1.2.

Tabela 1.2. Niektóre białka o konserwatywnych sekwencjach przydatne w ustalaniu filogenetycznych związków bakterii

-------------------------------------------------------------
Białka szoku termicznego Hsp 70, Hsp 60, Hsp 75
Syntaza alanylo-tRNA
Syntaza asparaginylo-tRNA
Dehydrogenaza glutaminianowa
CTP syntaza
Hydrolaza pirofosforanu (PPaza)
Podjednostki polimerazy RNA (RpoB, RpoC, RpoD)
Czynniki elongacyjne: EF 1α /Tu, EF-Tu, Ef-G/2
Białka rybosomowe: L2, L5, L11, L14, L15, L22, L23, S5, S12
Gyrazy GyrA, Gyr B
Białko uczestniczące w rekombinacji i naprawie DNA RecA
-------------------------------------------------------------

Na podstawie sekwencji SSU określane są granice taksonomiczne dla taksonów wyższych niż gatunek. Zmienność drobnoustrojów postępuje zaskakująco szybko, stąd drzewa filogenetyczne na niższych poziomach taksonomicznych są bardzo złożone, a nawet trudne do wykreślenia. Przyczyną tego jest horyzontalna wymiana genów (HGT) zachodząca nie tylko w obrębie szczepów czy gatunków, ale także rodzajów, a czasem bardziej odległych filogenetycznie taksonów. Obok procesów rekombinacyjnych związanych z koniugacją, transformacją czy transdukcją wymiana genów między bakteriami dokonuje się także przez czynniki fagopodobne GTA (ang. gene transfer agents) czy też przez nanorurki (ang. nanotubes). Ocenia się, że w przebiegu ewolucji prawie wszystkie geny zostały dotknięte horyzontalną wymianą ich fragmentów, a między niektórymi rodzajami zjawisko powtórzyło się do kilkuset razy. Zapewne z tego powodu tak trudne jest zdefiniowanie pojęcia gatunku bakterii. Powinna to być kategoria opisująca monofiletyczną, zwartą genetycznie, podobną i wyposażoną w odróżniające cechy grupę izolatów. Jednak wyznaczenie mierzalnych parametrów do jej opisu zależy od przyjętej perspektywy i dlatego definicja ta, w przypadku bakterii, jest bardzo niedoskonała. Obecne w SSU zmiany powstałe na przestrzeni czasu okazały się zbyt małe, by narzędzie to stało się wystarczająco dyskryminacyjne w przypadku niższych taksonów i przydatne w rutynowej diagnostyce w identyfikacji „do gatunku” czy „do wirotypu”. Na tym poziomie sekwencja ta, jako jedyna cecha, pomocna jest w genetycznej identyfikacji tylko nielicznych bakterii.

Mimo trudności, jakie dotyczą organizmów prokariotycznych, konieczne było stworzenie definicji gatunku. Przyjęto kryteria, które określają, że jest nim grupa szczepów (w tym jeden uznany za szczep wzorcowy), które łączy przynajmniej 70% homologii pełnego genomowego DNA wykazanego na drodze DDH (hybrydyzacja DNA–DNA). Różnica temperatur topnienia (ΔT_(m)) hybrydy badanej i w pełni homologicznej wyniesie wtedy 5°C lub będzie niższa. Wobec dużego usprawnienia techniki sekwencjonowania kryterium to bywa zastępowane przez łatwiejsze do wykazania ANI (ang. average nucleotide identity), podobieństwo genów wspólnych, ortologów. Wykazano, że podobieństwo na poziomie 96% ANI odpowiada homologii 70% DDH. W 2006 roku podwyższono wymagany próg identyczności sekwencji 16S rRNA z 97% do 98,7%. U wielu gatunków znaczenie ma udział zasad G + C w DNA genomu; dopuszcza się różnice wśród szczepów w obrębie gatunku o nie więcej niż 3 mol%. Zakłada się, że cecha ta w obrębie rodzaju może różnić gatunki tylko o 10 mol%, ale są rodzaje, jak na przykład Rickettsia, w których odsetek ten jest niższy. W definicji gatunku bierze się jednak także pod uwagę podobieństwo genów kodujących cechy podstawowego metabolizmu komórkowego (ang. housekeeping genes) i innych charakterystycznych dla określonej grupy drobnoustrojów cech genotypowych. Odpowiednio dobrane sekwencje dostarczają dodatkowych ważnych markerów molekularnych do identyfikacji bakterii wielu grup. Jednak muszą być one specyficzne dla każdego gatunku. Do celów diagnostycznych należy bowiem wybrać te geny, które należą do rdzenia pangenomu danego gatunku. Pangenom jest zbiorem wszystkich genów obecnych w genomach ogółu szczepów tworzących gatunek. Jest on wielokrotnie większy niż genom każdego z nich. Dlatego znalezienie wystarczająco dyskryminacyjnych sekwencji wspólnych jest nieraz trudnym zadaniem.

Budowanie taksonomii może się opierać na dwóch podstawowych systemach: systemie filogenetycznym badającym pokrewieństwo na podstawie cech najwcześniej wyrażonych w ewolucji (kladystyka), ale i fenetycznym bazującym na cechach obecnie prezentowanych fenotypowo. We współczesnej taksonomii znajdują swoje miejsce oba te systemy. W podziałach kladystycznych dokonuje się wyboru cech, nadając im różną wagę i rangę, w podejściu fenetycznym (numerycznym) rozpatruje się bardzo liczną grupę cech, nadając im jednakową rangę i poddając wyniki analizie matematycznej. Taksonomia numeryczna wykorzystuje wiele fenotypowych cech drobnoustrojów, buduje na ich podstawie dendrogramy i wylicza w analizie numerycznej współczynniki podobieństwa poszczególnych szczepów. Leży ona u podstaw handlowych testów obejmujących zestawy prób biochemicznych do identyfikacji różnych grup bakterii, np. systemu API.

Największą liczbę dostępnych danych analizuje się w taksonomii polifazowej, która zakłada integrację danych pochodzących z analizy filogenezy oraz cech genotypowych i fenotypowych identyfikowanego organizmu (tab. 1.3). Jest to taksonomia zmierzająca do uzyskania konsensusu wynikającego z porównywania tych wszystkich cech. Przytoczona tu tabela autora tego systemu nie zawiera jeszcze, jako źródła informacji taksonomicznej, pełnej sekwencji genomowego DNA, ale zdaniem wielu badaczy będzie ona dołączona i zastąpi część wskazywanych pierwotnie przez Vandamme’a cech charakteryzujących materiał genetyczny.

Tabela 1.3. Cechy i metody badawcze uwzględniane w taksonomii polifazowej (zmodyfikowane wg Vandamme’a)

DNA genomowy

mol% G + C
wzory restrykcyjne (RFLP, PFGE)
wielkość genomu
hybrydyzacja DNA–DNA
ANI

Segmenty DNA

fingerprinting oparty na PCR: rybotypowanie, ARDRA, RAPD, AFLP
sondy genetyczne
sekwencjonowanie DNA

RNA

sekwencje
profile masy cząsteczkowej

Białka

wzory elektroforetyczne: białka komórkowe; białka ściany
wzory elektroforetyczne izoenzymów

Markery chemotaksonomiczne

komórkowe kwasy tłuszczowe
kwasy mykolowe
hydrofobowe łańcuchy boczne lipidów: izoprenoidy i kwasy tłuszczowe i ich estry

lipidy polarne membrany cytoplazmatycznej
benzochinony i naftochinony (menachinony)
poliaminy kowalencyjnie wiązane z peptydoglikanem
elementy ściany komórkowej, peptydoglikan
wielocukry zewnątrzkomórkowe

Cechy fenotypowe

morfologia
cechy biologiczne
metabolizm (w systemach numerycznych)
enzymologia (zymogramy)
budowa antygenowa

RFLP – ang. restriction fragment lenght polymorphism; PFGE – ang. pulsed-field electrophoresis; AFLP – ang. amplified fragment length polymorphism; RAPD – ang. random amplified polymorphic DNA; ARDRA – ang. amplified ribosomal DNA restriction analysis.

Aktualnie strategia postępowania identyfikacyjnego nieznanego szczepu rozpoczyna się od oceny wyniku badania MALDI-TOF MS (ang. matrix-assisted-laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry), następnie obejmuje analizę podobieństwa sekwencji 16S rRNA na poziomie 98,7%, a w przypadku odmienności sięga się po porównanie identyczności sekwencji ortologów i/lub sekwencjonowanie. Ocena szeregu cech fenotypowych i charakterystyka chemotaksonomiczna dopełniają schematu badania. Postępowanie to może pozwolić na zakwalifikowanie badanego szczepu do gatunku już znanego lub na opisanie nowych gatunków, jak to było w przypadku dołączonego do LPSN (ang. List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature) w 2014 roku Enterobacter massiliensis.

Według przyjętej obecnie zasady SSSD (ang. single strain species description) w obrębie każdego gatunku jeden szczep stanowi zawsze wzorzec (ang. type strain) – jest to zazwyczaj izolat danego gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany (szczep referencyjny, typowy). Szczepy takie są przechowywane i odpłatnie udostępniane z kolekcji muzealnych. Do największych należą: kolekcja amerykańska ATCC – American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA; kolekcja czeska CNCTC – Czech National Collection of Type Cultures, National Institute of Public Heath, Praha; niemiecka DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig; szwedzka CCUG – Culture Collection, University of Göteborg czy JCM – Japan Collection of Microorganisms. Polska Kolekcja Drobnoustrojów PCM – Polish Collection of Microorganisms, znajdująca się w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, dysponuje dużą kolekcją szczepów bakterii i bakteriofagów i ma status IDA (ang. International Depositary Authority), źródła szczepów do celów patentowych.

Nazwanie gatunku na podstawie opisu pojedynczego szczepu, a tym samym podejście, w którym także opis gatunku opiera się na cechach, jakie demonstruje ten szczep wzorcowy, jest jednak obecnie krytykowane. Wydaje się, że już w niedalekiej przyszłości podstawą klasyfikacji drobnoustrojów może się stać zapis pełnej sekwencji genomów wielu szczepów danego gatunku oraz wyniki bardziej zaawansowanych technik molekularnych. Obserwujemy bowiem ogromny postęp w metodach badawczych określanych mianem OMICS (od końcówek angielskich nazw: proteomics, transcryptomics czy culturomics). Dysponujemy także wysokowydajnymi systemami chemotaksonomicznymi, takimi jak np. MALDI-TOF MS lub ICP-FT MS (ang. high field ion cyclotron fourier transform mass spectroscopy), które mogą zbadać wiele szczepów określonego taksonu i w konsekwencji lepiej pokazać zróżnicowanie wewnątrz- i międzygatunkowe. Duże znaczenie przypisywane jest włączaniu najnowszych metod porównawczych stosowanych w badaniach metabolomicznych. Podkreśla się, że potrzebne są nowe zasady pozwalające na wskazanie tych szczególnych właściwości, które odróżnią nowy takson od jemu pokrewnych.

Klasyfikacja bakterii, zdaniem wielu badaczy, musi korzystać z licznych narzędzi badawczych, szczególnie wówczas, gdy ma służyć identyfikacji lub opisowi nieznanych gatunków. Mimo ogromnej liczby nowych, nieznanych sekwencji 16S rRNA deponowanych w bazach danych, rocznie opisuje się znacznie mniej nowych gatunków. Wprowadzenie nowego gatunku na listę drobnoustrojów wymaga bowiem, obok opublikowania w NCBI nieznanej dotychczas sekwencji ich małej podjednostki RNA (SSU), także wskazania miejsca izolacji oraz podania charakterystyki fenotypowej różnicującej go od gatunków już znanych, co wymaga jego hodowli. Przeprowadzana jest też analiza nowej nazwy, trzeba też wskazać miejsca zdeponowania szczepu wzorcowego w kolekcjach. Opis tego gatunku musi być zaakceptowany przez grono redakcyjne i opublikowany jako pełnotekstowa praca w International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM). Oczekuje się także, chociaż obecnie zrealizowano to zaledwie w przypadku kilkuset gatunków, wskazania miejsca dostępu do pełnej sekwencji jego genomu. Coraz częściej sugeruje się, że także sam DNA wyekstrahowany z tych bakterii powinien być, podobnie jak wzorcowe szczepy, deponowany w kolekcjach dostępnych publicznie.

Kontrowersyjną kwestią, która coraz częściej pojawia się w dyskusjach, jest stworzenie zasad klasyfikacji tych drobnoustrojów, których obecność i odrębność od tych już poznanych jest stwierdzona jedynie na podstawie sekwencji ich DNA. Są to sekwencje najczęściej wykryte w badaniach metagenomicznych. Bakterie te, jeśli nie udało się ich wyhodować, są obecne jedynie jako dane in silico. Mamy świadomość, że spośród mikroorganizmów obecnie żyjących na ziemi umiemy wyhodować zaledwie 1–2%. Mimo rozwoju nowych technik, dzięki dziedzinie nazwanej kulturomika, z pewnością długo jeszcze nie będziemy umieli namnożyć ich tak, by zbadać właściwości wszystkich tych, których sekwencje 16S rRNA zostały poznane. Tym samym nie będziemy mogli spełnić kryteriów niezbędnych obecnie do opisania ich jako nowych gatunków. Wydaje się jednak, że wciągnięcie ich do odpowiednio zbudowanego systemu klasyfikacji jest potrzebne, a więc nieuchronne. Do spisu gatunków prokariotów zawartego w LPSN już obecnie dołączono nazwy poprzedzone słowem Candidatus. Są to nowe nazwy przyjęte dla szczepów wzorcowych, które jeszcze nie spełniają wszystkich warunków przyjętych jako niezbędne do zaakceptowania ich jako nowego gatunku, ale wiedza o nich, zwykle przede wszystkim pochodząca z analizy genomu, jest już bardzo duża.

Współpraca różnych grup badawczych i jednostek naukowych tworzących bazy gromadzące sekwencje mikroorganizmów i konstruujących na ich podstawie drzewa podobieństw pozwoliła na tworzenie projektów scalających otrzymywane przez nie dane. Obecnie, w 2018 roku, wiodącym projektem jest, obok baz NBCI i Greengenes, projekt LTP – The All-Species Living Tree’ Project. Trzeba jednak podkreślić, że nie istnieje żadna oficjalna klasyfikacja organizmów prokariotycznych. Potrzeba tworzenia systemów porządkujących ich zbiór jest jednak oczywista. Obecnie najbogatszym i uaktualnianym źródłem wskazującym na pokrewieństwo i bogactwo poszczególnych jednostek taksonomicznych jest utworzona przed 20 laty przez profesora J. Euzeby’ego internetowa lista LPSN powszechnie dostępna na stronie www.bacterio.net. Jest na niej obecnie ponad piętnaście tysięcy sześćset gatunków i prawie sześćset podgatunków bakterii. Ostatnia znacząca aktualizacja drzewa pokrewieństw została sporządzona w lipcu 2018 roku (www.bacterio.net/-classifphyla.html). Połączono w niej dane dostarczone przez Taxonomic Outline of Bacteria and Archaea (TOBA) taksonomii NCBI (National Centre for Biotechnology Information), Taxonomic Outline of Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology oraz sugestie LTP (Living Tree Project). Obejmuje ona 2 domeny, 39 typów, 89 klas i 1 podklasę, 197 rzędów i 20 podrzędów, 446 rodzin i 2857 rodzaje. W tabeli 1.4 zawarte są wszystkie dotychczas nazwane najwyższe taksony obecne na tej liście klasyfikacyjnej. W stosunku do wersji z 2012 roku pokazanej w poprzednim wydaniu tej książki jest ona wyraźnie liczniejsza. Wiele jednak wyższych jednostek systematycznych pozostaje nienazwanych. Wydzielono je jednak, bo genetyczna charakterystyka zaliczonych do nich gatunków wskazuje na ich odmienność, co powoduje, że nie mieszczą się w innych nazwanych jednostkach. Pokazuje to, jak bardzo dynamiczny jest obecnie proces tworzenia klasyfikacji prokariotów. Po opisy poszczególnych jednostek taksonomicznych LPSN kieruje do bazy internetowej, e-książki, jaką jest Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria (BMSA).

W tabeli 1.4 widać, jaki, w gruncie rzeczy niewielki, udział w świecie organizmów prokariotycznych mają bakterie o uznanej chorobotwórczości dla ludzi i zwierząt stanowiące obiekt zainteresowania rutynowej diagnostyki bakteriologicznej. Znacznie obszerniejsza, obejmująca więcej klas jest obecnie lista tych prokariotów, które wykryto w organizmie człowieka w czasie badań ludzkiego mikrobiomu, a których obecności nie wiąże się z chorobami infekcyjnymi. O mikrobiomie człowieka mowa jest w rozdziale 22 tej książki.

Żaden z systemów taksonomicznych nie jest pozbawiony wad. Żaden też nie może być uznany za ostateczny i zamknięty. Obecnie przyjęty system oparty na szkielecie, jakim jest SSU, uzupełniany jest wynikami uzyskiwanymi innymi metodami molekularnymi, obejmującymi inne markery oraz dane uzyskiwane w wyniku sekwencjonowania. Niekiedy jednak otrzymywane w ten sposób dane nie w pełni pokrywają się z wynikami uzyskiwanymi przez analizę cech fenotypowych. Trzeba pamiętać, że geny wyznaczają jedynie potencjalne możliwości komórek, a środowisko bytowania wymusza naturalną selekcję będącą podstawą ich ewolucji. Dlatego tylko analiza wielu cech, w tym szeroko pojętego fenotypu, która pozwala na stworzenie całościowego (holistycznego) obrazu, szczególnie najniższych jednostek taksonomicznych: gatunków i podgatunków, daje szansę na ich precyzyjne sklasyfikowanie.

Każdy proces diagnostyczny prowadzony w laboratorium klinicznym zaczyna się od wyznaczenia kierunku badań. Trzeba określić, jakie mikroorganizmy znajdują się w przesłanym materiale pobranym od pacjenta, w jakiej są proporcji i które z nich należy uznać za czynnik etiologiczny infekcji. To trudne zadanie, w którego rozwiązaniu biorą udział różne osoby: lekarz kierujący próbkę do badania i mikrobiolodzy – diagności wykonujący badanie. W przypadku próbek klinicznych istotna jest znajomość patogenezy chorób i metod diagnostycznych, które pozwolą na szybkie otrzymanie wyniku. Nie jest obecnie możliwe rutynowe zastosowanie metod metagenomiki do badania każdej pobranej próbki. Tylko takie badanie określiłoby, na podstawie zawartego w niej DNA, pełną różnorodność będących w niej drobnoustrojów, ich liczebność i proporcje, a także obecność genów toksyn czy oporności. Wskazuje się jednak na możliwość nieodległego w czasie zastosowania sekwencjonowania nowej generacji (NGS) połączonego z opartymi na odpowiednich algorytmach systemami opracowania otrzymywanych danych.

Tabela 1.4. Wyższe taksony organizmów prokariotycznych obecne w klasyfikacji LPSN w 2018 r.

---------- -------------------------------- ----------------------- -------------------------------------------
Domeny Typy (Phylum) Liczba nazwanych klas Typy obejmujące uznane patogeny człowieka
Archaea Crenarchaeota 1
Euryarchaeota 8
Korarchaeota –
Nanoarchaeota –
Thaumarchaeota 1
Bacteria Acidobacteria 3
Actinobacteria 6 ██
Aquificae 1
Armatimonadetes 2
Bacteroidetes 6 ██
Balneolaeota 1
Caldiserica 1
Calditrichaeota –
Chlamydiae 1 ██
Chlorobi 3
Chloroflexi 7
Chrysiogenetes 1
Cyanobacteria –
Deferribacteres 1
Deinococcus-Thermus 1
Dictyoglomi 1
Elusimicrobia 1
Fibrobacteres 3
Firmicutes 7 ██
Fusobacteria 1
Gemmatimonadetes 2
Kiritimatiellaeota 1
Lentisphaerae 2
Nitrospira/Nitrospirae 1
Planctomycetes/Planctobacteria 2
Proteobacteria 7 ██
Rhodothermaeota 1
Spirochaetes/Spirochaetae 1 ██
Synergistetes 1
Tenericutes 1 ██
Thermodesulfobacteria 1
Thermotogae 1
Verrucomicrobia 3
---------- -------------------------------- ----------------------- -------------------------------------------

Obecnie w zdecydowanej większości przypadków opieramy się na metodach hodowlanych, przynajmniej w początkowym etapie badania. Diagnostyka bakteriologiczna polega na izolacji, wyborze i określeniu cech komórek drobnoustrojów zawartych w próbce. Zastosowanie w niej coraz to nowych i coraz doskonalszych technik badawczych pozwala na osiągnięcie celu, jakim jest bezbłędne przyporządkowanie ich do właściwego taksonu oraz określenie profilu jego wrażliwości na leki. W powszechnym użyciu są systemy biochemiczne wykorzystujące metody turbidymetryczne i kolorymetryczne zarówno manualne, jak i coraz bardziej zautomatyzowane. Różne modele aparatów pozwalają na jednoczesne badanie wielu próbek i otrzymywanie wyników nawet już po kilku godzinach od pobrania. Coraz powszechniej stosowane są metody spektrofotometryczne, przede wszystkim wspomniana wcześniej MALDI-TOF MS. W tym systemie jonizacja całych komórek mikroorganizmów z użyciem promieniowania laserowego i przyspieszenie ruchu powstałych cząstek w próżni w polu elektrycznym pozwalają na uzyskanie wzorów białkowych – wysokospecyficznych, spektrofotometrycznych profili molekularnych. Niezwykła szybkość tego oznaczenia ograniczona nawet do 10 minut oraz dostępność specjalnie przystosowanych do tych oznaczeń aparatów stawiają je obecnie na czele wysokoprzepływowych technik wskazywanych do wykorzystania w rutynowej praktyce. Proponowane są także metody elektromigracji oparte na specyfice biopolimerów powierzchniowych komórek bakteryjnych, których różnorodność pozwala na traktowanie ich jako biokoloidów charakterystycznych dla danego gatunku. W przypadku niektórych materiałów bardzo pomocne są metody immunomikroskopowe. W rutynowych postępowaniach diagnostycznych wykorzystywane są także metody molekularne poszukujące w zawartych w próbce kwasach nukleinowych określonych, charakterystycznych dla patogenów sekwencji, w tym różne warianty techniki PCR czy amplifikacji w stałej temperaturze. Metody te i ich obecne wykorzystywanie opisane są w rozdziale 38 tej książki. Poszukiwania nowych metod trwają, gdyż cel, czyli pewność i jednoznaczność identyfikacji, jak najkrótszy czas jej uzyskania, a także jak najniższe koszty dla wielu taksonów ciągle nie są osiągnięte.

Stosowane nawet najnowsze metody diagnostyczne, mimo czasem entuzjastycznych opinii pojawiających się w literaturze, często zawodzą, a przyczyn tego stanu jest wiele. Bezpośrednie badanie materiałów klinicznych, nawet takich, w których nie należy się spodziewać różnorodności bakterii, jest trudne do zrealizowania. Zastosowanie zaawansowanych metod najczęściej wymaga oczyszczania materiałów klinicznych, co wydłuża nawet najkrótszą procedurę. W przypadku badania MALDI-TOF MS wykonywanego np. bezpośrednio z krwi trzeba usunąć białka inne niż drobnoustrojowe. Obiecujące proste techniki molekularne szybko wykryją w mieszaninie różnych kwasów nukleinowych DNA poszukiwanych patogenów, ale nie dają pewności, że pochodzi on z żywych bakterii odpowiedzialnych za właśnie toczącą się infekcję.

W większości technik pierwszym i najtrudniejszym etapem jest wskazanie, które z obecnych w materiale klinicznym bakterii są rzeczywistym czynnikiem etiologicznym. Wiedza, jaką przyniosły ostatnie lata, pokazująca, jak liczne i różnorodne bakterie zasiedlają ciało człowieka, każe z jeszcze większym zastanowieniem o tym decydować. Diagnosta-mikrobiolog względnie łatwo podejmie decyzję, znajdując w materiale klinicznym bezwzględne patogeny, jednak wiele infekcji ma charakter mieszany, a najwięcej bakterii izolowanych w laboratoriach, uznawanych za przyczynę infekcji, stanowią patogeny oportunistyczne, które równie dobrze mogą być w badanej próbce składnikiem mikrobiomu obecnego w stanie zdrowia.

W rutynowych procedurach laboratoryjnych badanie próbki pochodzącej od pacjenta zaczyna się więc najczęściej posiewem na odpowiednie podłoża stałe. Ważna jest, a w przypadku niektórych materiałów podstawowa, liczba kolonii powstałych w wyniku tego posiewu, ale i różnorodność bakterii pozostających w próbce w mniejszości. Dobra decyzja diagnosty co do rodzaju podłoża, a potem ocena wyniku posiewu decyduje o dalszym postępowaniu. Ten etap jest najtrudniejszy do wykonania i musi trwać kilka, a najczęściej kilkanaście godzin. Dalszy etap: wybór techniki identyfikacji bakterii zależy zwykle od profilu i wyposażenia laboratorium. Nowoczesne techniki biochemiczne i spektrofotometryczne mają wiele ograniczeń, jednak wydaje się, że największym ograniczeniem jest wielkość i konstrukcja baz danych, na których podstawie odczytywane są wyniki. Automatyczne techniki biochemiczne prawidłowo identyfikują wprawdzie około 80% bakterii, ale, jak podkreśla się w badaniach, pewność identyfikacji dotyczy tylko ich rodzaju. W przypadku MALDI-TOF MS, mimo że niektóre bazy obejmują nawet cztery tysiące gatunków, nierzadkie są sytuacje, gdy wynik identyfikacji rozdziela prawdopodobieństwo przyporządkowania między dwa, a czasem i trzy gatunki. Przyczyna tkwi zapewne w przedstawionej wyżej zasadzie identyfikacji gatunków na podstawie SSSD. Wobec bogactwa pangenomów wielu gatunków zasada ta może prowadzić do błędów. W przypadku metod molekularnych tak często wskazywanych jako szybkie i bardzo czułe przeszkodą jest właśnie owa czułość, która pozwala wykryć w materiale klinicznym DNA patogenu długo po tym, jak już w organizmie nie ma żywych komórek. Podkreśla się też niebezpieczeństwo wykrycia zanieczyszczeń pochodzących z pobierania, transportu czy procedur badawczych i oparcia diagnozy na takim właśnie wyniku.

Szeroka wiedza mikrobiologa prowadzącego badanie diagnostyczne w postępowaniu klinicznym ma istotne znaczenie. Brak wskazania patogenu i określenia profilu jego wrażliwości na leki przeciwdrobnoustrojowe prowadzi do terapii empirycznej, zwykle szerokowidmowej, w konsekwencji generującej wielooporność i niszczenie naturalnego mikrobiomu pacjenta.

We współczesnej diagnostyce bakteriologicznej wykorzystywane są różne narzędzia pozwalające na identyfikację bakterii na różnym poziomie ich klasyfikacji. Najbardziej pożądana jest identyfikacja do gatunku, a w dochodzeniach epidemiologicznych identyfikacja szczepu. Wyższe poziomy klasyfikacyjne rzadko są przedmiotem rutynowego zainteresowania mikrobiologów praktyków, chociaż z pewnością będą wykorzystywane, gdy powszechne stanie się diagnozowanie dysbiozy, ważne w chorobach nieinfekcyjnych. W tej książce na początku każdego rozdziału przedstawiono przynależność taksonomiczną każdego z opisanych rodzajów. Obecny tu podział na rozdziały daleki jest jednak od podziałów ściśle opartych na podobieństwie filogenetycznym. Nie ma on bowiem w diagnostyce tak wielkiego znaczenia, jak przy tworzeniu taksonomii. Wyznaczone rozdziałami grupy drobnoustrojów charakteryzuje wiele cech wspólnych, istotnych dla diagnosty, lekarza i epidemiologa.