Genetyka ogólna i weterynaryjna - ebook

AUTORZY

Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt

Wydział Medycyny Weterynaryjnej i Nauk o Zwierzętach

Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

prof. dr hab. Marek Świtoński, czł. rzecz. PAN, dr h.c.

dr hab. Jakub Cieślak

dr hab. Monika Dragan

prof. dr hab. Dorota Lechniak

dr Mariusz Maćkowski

dr hab. Zofia Madeja

prof. UPP dr hab. Joanna Nowacka-Woszuk

dr hab. Piotr Pawlak

prof. dr hab. Izabela Szczerbal

prof. UPP dr hab. Ewelina WarzychPRZEDMOWA

Dynamiczny rozwój genetyki molekularnej, genomiki i epigenomiki stworzył szerokie możliwości poznawania podłoża molekularnego zmienności cech oraz mutacji odpowiedzialnych za choroby i wady genetyczne zwierząt. Największy postęp odnotowano w przypadku gatunków zwierząt gospodarskich (bydło, świnia i koń) oraz towarzyszących (pies i kot). Efektem prowadzonych badań było opracowanie nowych i bardzo efektywnych metod badawczych, które są obecnie powszechnie wykorzystywane w diagnostyce weterynaryjnej oraz ocenie wartości hodowlanej zwierząt gospodarskich.

Niniejsza książka jest nowym opracowaniem, ale nawiązuje do dwóch wcześniejszych podręczników wydanych przez Wydawnictwo Naukowe PWN – Genetyka zwierząt (2000, 2004) oraz Genetyka i genomika zwierząt (2012) autorstwa Krystyny M. Charon i Marka Świtońskiego. Skupiono się w niej na zagadnieniach z zakresu genetyki weterynaryjnej, w tym: kontroli genetycznej gametogenezy oraz rozwoju zarodkowego i płodowego, przyczynach chorób i wad genetycznych oraz cytogenetycznych i molekularnych metodach wykrywania sprawczych mutacji. Przedstawiono również podstawy genomiki, epigenomiki, onkogenetyki i immunogenetyki, a także genetyki drobnoustrojów. Poruszono także kwestie dotyczące nowoczesnych biotechnologii, takich jak edytowanie genomu zwierząt z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas-9 oraz terapia genowa i komórkowa. Ważną częścią opracowania są rozdziały poświęcone podłożu molekularnemu zmienności umaszczenia i cech produkcyjnych.

Książka jest bogato ilustrowana, a najważniejsze informacje zamieszczono w ramkach. W treści książki nawiązano również do odkryć o kluczowym znaczeniu dla rozwoju genetyki, które zostały wyróżnione Nagrodami Nobla. Na końcu każdego rozdziału dodano wykaz literatury uzupełniającej. Ostatnim rozdziałem książki jest słownik wybranych terminów genetycznych, który w przystępny sposób pomaga czytelnikowi w zrozumieniu omawianych zagadnień.

Nad opracowaniem tej książki pracował 10-osobowy zespół, który tworzą specjaliści od wielu lat zajmujący się zgłębianiem tajników genetyki zwierząt. Książka jest adresowana przede wszystkim do studentów kierunku weterynaria, a także zootechnika, biotechnologia i biologia oraz doktorantów i specjalistów interesujących się genetyką zwierząt.

Marek Świtoński1
ZARYS HISTORII GENETYKI
MAREK ŚWITOŃSKI

Historia genetyki, zaczynając od momentu opublikowania w 1866 roku przez Gregora Mendla pracy naukowej pt. Badania nad mieszańcami roślin (tytuł oryg. Versuche über Pflanzen-Hybriden), liczy niecałe 160 lat. Termin „genetyka” po raz pierwszy został użyty dopiero w 1906 roku, a powiązanie wiedzy o mechanizmach dziedziczenia z zachowaniem chromosomów podczas podziału mejotycznego nastąpiło w pierwszej dekadzie XX wieku, za sprawą badań prowadzonych głównie przez Thomasa Morgana. Osiągnięcie to zostało wyróżnione Nagrodą Nobla w 1933 roku (dyscyplina: fizjologia i medycyna), a sentencja na dyplomie głosiła: for his discoveries concerning the role played by the chromosome in heredity. Warto zauważyć, że pierwszy polski podręcznik akademicki poświęcony genetyce zwierząt – „Zarys genetyki zwierzęcej” (Wydawnictwo Świętego Wojciecha w Poznaniu), autorstwa prof. Zygmunta Moczarskiego i dr. Jerzego Szumana z Uniwersytetu Poznańskiego, ukazał się już w 1927 roku i zawierał aktualną wówczas wiedzę z zakresu genetyki Mendlowskiej i chromosomowej teorii dziedziczenia (ryc. 1.1).

Rycina 1.1. Strona tytułowa pierwszego polskiego podręcznika akademickiego, liczącego 150 stron, na temat genetyki zwierząt

W połowie XX wieku rozpoczął się dynamiczny rozwój genetyki molekularnej, a za jego początek można uznać 1944 rok, kiedy trzech badaczy – Oswald Avery, Colin MacLoed i Maclyn McCarty wykazało kluczową rolę DNA jako nośnika informacji genetycznej. Model strukturalny tego związku zaproponowali James Watson i Francis Crick, w 1953 roku. Osiągnięcie to zostało wyróżnione Nagrodą Nobla (1962 rok), a jej laureatami było trzech badaczy – James Watson, Francis Crick oraz Maurice Wilkins. Sentencja umieszczona na dyplomie przyznającym nagrodę brzmiała: for their discoveries concerning the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living material. Wśród laureatów tej Nagrody nie było zmarłej w 1958 roku Rosalind Franklin, której krystalograficzne badania DNA miały ogromne znaczenie dla poznania budowy cząsteczki DNA. Kolejnym etapem rozwoju genetyki molekularnej było rozszyfrowanie kodu genetycznego, czyli ustalenie, jakie sekwencje 3 nukleotydów (kodonów) zawierają informację dotyczącą wbudowania aminokwasu podczas syntezy łańcucha polipeptydowego (translacji). Prace te prowadzone były przez kilka lat, na przełomie lat 50. i 60. XX wieku, a główną rolę odegrali Marshall W. Nirenberg, Har Gobind Khorana i Robert W. Holley, którzy w 1968 roku także zostali wyróżnieni Nagrodą Nobla – for their interpretation of the genetic code and its function in protein synthesis. Można zatem stwierdzić, że w pierwszej połowie lat 60. XX wieku stworzone zostały podwaliny genetyki molekularnej.

Praktyczne wykorzystywanie osiągnięć genetyki w hodowli zwierząt i weterynarii postępowało stopniowo i podobnie jak w przypadku genetyki człowieka było zależne od postępu wiedzy i dostępności technik badawczych. Począwszy od drugiej połowy XX wieku, na szeroką skalę wprowadzano w hodowli zwierząt statystyczne metody oceny wartości hodowlanej rozpłodników (głównie buhajów i knurów) pod względem cech produkcyjnych o złożonym, poligenowym uwarunkowaniu (np. wydajność mleka, tempo przyrostu masy ciała itp.). W tym okresie wprowadzono również badanie markerów genetycznych (na początku były to grupy krwi) na potrzeby weryfikacji zapisów rodowodowych. Na przełomie lat 60. i 70. zainteresowanie zyskały badania cytogenetyczne, których celem była identyfikacja nosicieli mutacji chromosomowych, głównie tych, które obniżają płodność lub wywołują bezpłodność. Ważnym osiągnięciem z tego zakresu było opracowanie na przełomie lat 70. i 80. XX wieku technik prążkowego barwienia chromosomów do precyzyjnej identyfikacji chromosomów homologicznych, co pozwoliło na opracowanie wzorca kariotypu człowieka, a następnie szeregu gatunków zwierząt. W 1976 roku odbyła się międzynarodowa konferencja, podczas której uzgodniono wzorce kariotypu kilku gatunków zwierząt domowych (m.in. bydła, świni i konia), które opublikowano w 1980 roku w czasopiśmie Hereditas.

W kontekście opisanych powyżej osiągnięć zaskakujące jest to, że dopiero w 1956 roku udało się ostatecznie ustalić diploidalną liczbę chromosomów człowieka (2n = 46). Na znaczenie badań cytogenetycznych w hodowli zwierząt i weterynarii wskazał prof. Ingemar Gustavsson, który w 1969 roku opisał szerokie rozprzestrzenienie fuzji centrycznej (translokacji Robertsona) między chromosomami nr 1 i 29 w szwedzkiej rasie bydła czerwono-białego. Mutacja ta ma niekorzystny, choć niewielki, wpływ na płodność jej nosicieli. Badania te zostały wprowadzone do praktyki hodowlanej w wielu krajach (głównie europejskich) i polegały one na diagnostyce młodych buhajów przed ich zakwalifikowaniem do wykorzystania w stacjach produkcji nasienia na potrzeby inseminacji. Nieco później, podczas V Europejskiej Konferencji Cytogenetycznej Zwierząt Domowych (Gargnano, Włochy, 1982), Ingemar Gustavsson zwrócił uwagę na występowanie dziedzicznych translokacji wzajemnych u świń i ich istotny wpływ na obniżenie liczebności miotu. Referat ten sprawił, że w niektórych krajach (np. Francji, a ostatnio również w Wielkiej Brytanii i Kandzie) uruchomiono system przesiewowych badań cytogenetycznych młodych knurów, przewidzianych do użytkowania w stacjach produkcji nasienia.

Poznanie podstaw genetyki molekularnej stworzyło warunki do rozkwitu inżynierii genetycznej, której dynamiczny rozwój rozpoczął się w latach 70. XX wieku. Opracowanie techniki klonowania molekularnego i rekombinacji molekularnej z wykorzystaniem drobnoustrojów (organizmy prokariotyczne) miało kluczowe znaczenie. Spektakularnymi efektami tego kierunku badawczego stały się tzw. leki rekombinowane, czyli białka terapeutyczne produkowane przez bakterie, do których wprowadzono plazmidy zawierające sekwencje kodujące białka człowieka. Pierwszym przykładem takiego leku była ludzka insulina syntetyzowana przez zmodyfikowane genetycznie pałeczki okrężnicy. Dokonano tego w 1978 roku, a już cztery lata później tak produkowana insulina została dopuszczona do stosowania w leczeniu cukrzycy typu 2 u ludzi. Od tego czasu powstało wiele leków i szczepionek rekombinowanych, w tym takie, które są dedykowane do stosowania w medycynie weterynaryjnej.

Sukcesy inżynierii genetycznej drobnoustrojów stworzyły warunki do rozwoju podobnych badań w odniesieniu do roślin i zwierząt. W hodowli roślin (soja, kukurydza, bawełna itd.) od początku XXI wieku wykorzystywane są na szeroką skalę rośliny GMO (ang. genetically modified organisms), do genomu których wprowadzono np. gen bakteryjny kodujący syntazę EPSPS, która chroni roślinę przed działaniem glifosatu – składnika herbicydów przeciw chwastom jedno- i dwuliściennym. Modyfikacje genomu zwierząt gospodarskich również są podejmowane, choć z mniejszą intensywnością niż w przypadku roślin uprawnych. Badania takie dotyczyły m.in. ulepszenia cech użytkowych, ale mimo zachęcających wyników dotąd do konsumpcji dopuszczono jedynie transgeniczne łososie atlantyckie, do genomu których wprowadzono konstrukt genowy składający się z genu hormonu wzrostu czawycza (morska ryba z rodziny łososiowatych), połączony z sekwencjami regulatorowymi genu kodującego białko przeciwzamarzaniowe węgorzycy amerykańskiej. Podkreślić natomiast należy, że powszechnie stosowana jest technika tzw. nokautu genowego u zwierząt laboratoryjnych, która pozwala na uzyskanie homozygotycznych zwierząt ze względu na uszkodzony eksperymentalnie gen. Technika ta znajduje zastosowanie m.in. w tworzeniu modeli zwierzęcych (głównie myszy) chorób monogenowych człowieka.

Przełomem w poznawaniu molekularnych mechanizmów dziedziczenia było podjęcie badań nad poznaniem genomów, czyli organizacji i funkcjonowania informacji genetycznej danego gatunku. Badania te określane są terminem „genomika”. Ich rozwój był możliwy dzięki opracowaniu nowych technik molekularnych, takich jak amplifikacja fragmentów DNA przy pomocy łańcuchowej reakcji polimerazy – technika PCR, czy sekwencjonowanie DNA. Opracowanie techniki PCR (ang. polymerase chain reaction) oraz sekwencjonowania DNA zostało uhonorowane Nagrodami Nobla w 1980 roku (Walter Gilbert i Frederick Sanger for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids) i w 1993 roku (Kary B. Mullis for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method). Pierwszym etapem badań organizacji genomu człowieka i zwierząt domowych było opracowywanie markerowych map genomowych, czyli wskazanie położenia loci anonimowych markerów genetycznych i genów w chromosomach oraz oszacowanie odległości genetycznych (wyrażanych częstością zachodzenia crossing over) między sprzężonymi loci. W latach 90. XX wieku uruchomiono międzynarodowe programy mapowania genomów m.in. świni (1991), bydła (1992), psa (1993) czy konia (1995). Efektem tych zakrojonych na szeroką skalę badań było ustalenie lokalizacji tysięcy markerów DNA, głównie typu sekwencji mikrosatelitarnych (ang. short tandem repeats, STR), rozproszonych w miarę równomiernie we wszystkich chromosomach danego gatunku. Mapy takie stały się narzędziem, które wykorzystywano do poszukiwania genów posiadających znaczący wpływ na zmienność cech poligenowych lub odpowiedzialnych za monogenowe choroby lub wady rozwojowe.

Doniosłym wydarzeniem związanym z rozwojem genomiki było ukazanie się w lutym 2001 roku specjalnych numerów dwóch prestiżowych czasopism – Nature oraz Science – w całości poświęconych wynikom badań sekwencji genomu człowieka. W kolejnych latach ukazały się publikacje dotyczące sekwencji genomowych zwierząt gospodarskich i towarzyszących: psa (2004, 2005), kury (2004), konia (2007), kota (2007), bydła (2009) i świni (2012). Badania te pokazały, że genomy są niezwykle polimorficzne, co oznacza, że występuje w nich wiele (miliony) wariantów sekwencji DNA, a najczęstszym typem polimorfizmu są podstawienia jednonukleotydowe (ang. single nucleotide polymorphism, SNP). Wiedza o ich dokładnej lokalizacji została wykorzystana do opracowania nowego narzędzia molekularnego – mikromacierzy SNP, które zostało szeroko wykorzystywane do tzw. skanowania genomu w celu identyfikacji markerów SNP występujących w pobliżu genów odpowiedzialnych za choroby dziedziczne, podatność na choroby infekcyjne czy zmienność cech (umaszczenie, cechy produkcyjne itp.). Istotnym wzmocnieniem badań sekwencji genomowych stało się opracowanie technik wysokoprzepustowego sekwencjonowania całych genomów (ang. whole genome sequencing, WGS; ang. next generation sequencing, NGS).

Mikromacierze SNP są stosowane od wielu lat do oceny wartości hodowlanej rozpłodników (buhaje, knury itd.), a procedura ta określana jest terminem „selekcja genomowa”. Z kolei identyfikacja mutacji genowych odpowiedzialnych za powstanie chorób dziedzicznych (głównie monogenowych) prowadzona jest przy pomocy obu technik – mikromacierzy SNP i całogenomowego sekwencjonowania (WGS).

Wiedza o wariantach genowych istotnie związanych ze zmiennością cech poligenowych lub odpowiedzialnych za rozwój chorób monogenowych jest dynamicznie poszerzana. Świadczy o tym baza Online Mendelian Inheritance in Animals – OMIA (https://omia.org/home/), która powstała na wzór bazy Online Inheritance in Man – OMIM (https://www.omim.org/), w której zgromadzono dotąd informacje o mutacjach ponad 16 tys. genów odpowiadających głównie za monogenowe choroby dziedziczne człowieka. W bazie OMIA liczba zidentyfikowanych mutacji na poziomie molekularnym jest znacznie mniejsza, ale na tyle obszerna, że wykorzystanie tej wiedzy w praktyce hodowlanej i weterynaryjnej stało się powszechne, o czym świadczy oferta wielu laboratoriów diagnostycznych. Obecnie baza OMIA zawiera informacje o ponad 1500 wariantach DNA odpowiedzialnych głównie za powstanie monogenowych chorób dziedzicznych, wśród których większość ma odpowiedniki w chorobach człowieka. Najwięcej takich mutacji sprawczych zidentyfikowano dotąd u psów, bydła i kotów. Podkreślić należy, że szereg tych wariantów zidentyfikowano dzięki wiedzy o podłożu molekularnym chorób dziedzicznych człowieka.

Na początku lat 90. XX wieku wprowadzono do praktyki hodowlano-weterynaryjnej badania przesiewowe knurów i buhajów przewidzianych do użytkowania w stacjach produkcji nasienia, których celem była identyfikacja zdrowych nosicieli niepożądanych mutacji genowych. Pierwszymi obiektami tych analiz były recesywne mutacje genów RYR1 (świnie, różne rasy ) i CD18 (bydło, rasa holsztyńsko-fryzyjska). Mutacja genu RYR1 odpowiada za gorączkę złośliwą (ang. malignant hyperthermia, MH), podatność na stres i niską jakość tuszy. Z kolei mutacja genu CD18 wywołuje wrodzony niedobór leukocytarnych cząstek adhezyjnych (ang. bovine leukocyte adhesion deficiency, BLAD), który prowadzi do upośledzenia funkcji układu odpornościowego. Wieloletnia selekcja przeciw nosicielom niepożądanych mutacji doprowadziła do niemal całkowitej ich eliminacji.

Porównawcza analiza podłoża chorób dziedzicznych człowieka i zwierząt domowych wykazała, że większość z nich wywołana jest mutacjami tych samych genów (ortologów), czyli mających wspólne pochodzenie ewolucyjne. Oznacza to, że gen, którego mutacje wywołują chorobę genetyczną człowieka, może być uznany za gen kandydujący, czyli taki, którego mutacja może odpowiadać za analogiczną chorobę zwierząt domowych różnych gatunków. Dzięki temu postępy genetyki chorób dziedzicznych człowieka przyczyniają się do identyfikacji podłoża molekularnego dziedzicznych chorób zwierząt. Podobieństwo molekularne chorób monogenowych człowieka i zwierząt stworzyło możliwości wykorzystania zwierząt domowych (np. psa) jako modeli biomedycznych w pracach nad opracowaniem procedur terapii genowej. Jedną z pierwszych takich chorób, dla której testowano terapię genową, jest wrodzona niepostępująca nocna ślepota (ang. congenital stationary night blindness, CSNB) psów rasy briard. Choroba ta ma swój odpowiednik u dzieci – wrodzona ślepota Lebera (ang. Leber congenital amaurosis, LCA). Zarówno u psów, jak i ludzi jest ona wywołana recesywną mutacją genu RPE65. Przeprowadzona na początku XXI wieku skuteczna terapia tej choroby u psów, połączona z wieloletnią oceną jej efektów, przyczyniła się do opracowania terapii genowej dla chorych dzieci, która w 2018 roku została zaakceptowana do stosowania przez amerykańską Agencję Żywności i Leków (ang. Food and Drug Administration, FDA). Ten przykład pokazuje szerokie perspektywy rozwoju tzw. medycyny translacyjnej, której procedury terapeutyczne są opracowane w oparciu o badania podstawowe prowadzone m.in. z wykorzystaniem zwierząt gospodarskich lub towarzyszących.

Opracowanie techniki edycji genomu, głównie opartej na bakteryjnym systemie CRISPR/Cas9, miało bardzo ważne znaczenie w badaniach, których celem było uzyskiwanie modeli zwierzęcych chorób dziedzicznych człowieka. Technika CRISPR/Cas9 pozwala na precyzyjne wprowadzanie zmian w wytypowanej sekwencji nukleotydowej genu lub sekwencji pozagenowej. Przykładem jest edycja genu APC świni, przeprowadzona w 2012 roku, polegająca na wprowadzeniu zmiany jednego nukleotydu w miejscu, które w genie APC człowieka odpowiada za powstanie zespołu rodzinnej polipowatości jelita grubego (ang. familial adenomatous polyposis, FAP). W ten sposób utworzono model do badań nad nowymi terapiami tej rzadkiej choroby człowieka. O przełomowym znaczeniu technik edycji genomu świadczy fakt, że w 2020 roku główne autorki tego odkrycia, Emmanuelle Charpentier i Jennifer Doudna, zostały uhonorowane Nagrodą Nobla for the development of a method for genome editing.

Rozwój genetyki w Polsce, w minionych 60 latach, jest związany z powstaniem Polskiego Towarzystwa Genetycznego (PTG, http://ptgen.pl/) w 1963 roku oraz Polskiego Towarzystwa Genetyki Człowieka (PTGC, https://ptgc.pl/) w 1993 roku. Towarzystwa organizują m.in. cykliczne kongresy i sympozja naukowe. Bardzo ważnym wydarzeniem było powołanie w 1960 roku, z inicjatywy prof. Stefana Barbackiego, pierwszego polskiego czasopisma poświęconego genetyce – Genetica Polonica, którego właścicielem jest Instytut Genetyki Roślin PAN w Poznaniu. W czasopiśmie publikowane są prace naukowe z zakresu genetyki człowieka, zwierząt, roślin i mikroorganizmów. W 1995 roku zmieniono tytuł czasopisma na Journal of Applied Genetics (https://www.springer.com/journal/13353). Czasopismo jest od wielu lat uwzględnione w prestiżowych międzynarodowych bazach bibliograficznych, takich jak: Web of Science (w tym Journal Citation Reports) i Scopus.

Rycina 1.2. Okładka czasopisma Journal of Applied Genetics

Współczesna medycyna weterynaryjna i hodowla zwierząt wykorzystują na szeroką skalę najnowsze osiągnięcia genetyki molekularnej, cytogenetyki i genomiki. Celem niniejszego podręcznika jest prezentacja aktualnej wiedzy z tych zakresów oraz możliwości jej praktycznego wykorzystania w medycynie weterynaryjnej i translacyjnej oraz selekcji zwierząt. Podręcznik jest adresowany do studentów interesujących się genetyką zwierząt gospodarskich (przede wszystkim bydło, świnia i koń) i towarzyszących (pies i kot), w szczególności kierunku weterynaria, a także kierunków zootechnika, biotechnologia i biologia.

Literatura uzupełniająca

Gayon J. (2016). From Mendel to epigenetics: History of genetics. Comptes Rendus Biologies 339 (7–8): 225–230.