Przemysłowe wykorzystanie mikroorganizmów - ebook

2

Ulepszanie mikroorganizmów przemysłowych

2.1.Wprowadzenie

Mikroorganizmy przemysłowe stosuje się do produkcji w procesie fermentacji szerokiej gamy produktów wykorzystywanych w życiu codziennym człowieka oraz w wielu gałęziach gospodarki. Są one szczególnie przydatne ze względu na łatwość masowej hodowli na podłożach konstruowanych na bazie odpadów przemysłu rolno-spożywczego i szybki wzrost (przyrost biomasy) oraz ze względu na różnorodność produktów powstających przy ich udziale. Łatwo poddają się różnym manipulacjami genetycznym stosowanym w celu wytworzenia w skali masowej produktów o dużej czystości.

Tradycyjne fermentacje, jak np. warzenie piwa czy fermentacja alkoholowa, były początkowo wykonywane (i nadal są w wielu przypadkach) przez mieszaninę dzikich mikroorganizmów pochodzących z surowców lub środowiska lokalnego. Pierwsze próby ulepszania mikroorganizmów były czynione w końcu XIX w., kiedy po raz pierwszy izolowano je z tych procesów jako czyste szczepy, z których następnie wybrano szczepy najbardziej użyteczne (czasy Ludwika Pasteura). Konkretnie stosowane mikroorganizmy na skalę przemysłową były często izolowane ze środowiska naturalnego, głównie z gleby, która wykazuje największą różnorodność biologiczną. Wiązało się to z losowym przesiewaniem dużej liczby izolatów. Alternatywnie, pewne mikro­organizmy uzyskano z kolekcji szczepów. W celu poprawy ich właściwości do zastosowań przemysłowych większość z nich, niezależnie od pochodzenia, zmodyfikowano za pomocą konwencjonalnych strategii ulepszania szczepów z wykorzystaniem mutagenezy lub hodowli. W ostatnich dekadach opracowano kilka sposobów rekombinacji mikroorganizmów, a do poprawy właściwości szczepów przemysłowych coraz częściej stosuje się technologie inżynierii genetycznej.

W większości przypadków przy doborze mikroorganizmów do zastosowań przemysłowych mają ogromne znaczenie regulacje prawne. Przemysł fermentacyjny woli stosować ustanowione mikroorganizmy GRAS (ogólnie uważane za bezpieczne), w szczególności do wytwarzania produktów i składników spożywczych. Wynika to z faktu, że zatwierdzenie technologii i produktu przy użyciu „nowego” mikroorganizmu jest bardzo rygorystyczne i kosztowne. Ponadto, jeżeli patogeny i niektóre GMO wykorzystuje się jako organizmy producenta, należy podjąć dodatkowe środki bezpieczeństwa. Trzeba zastosować specjalne urządzenia zabezpieczające i używać zmodyfikowanych („okaleczonych”) szczepów, które nie mogą istnieć poza środowiskiem bioreaktora.

2.2.Metabolity produkowane przez mikroorganizmy

2.2.1. Metabolity pierwotne

Według firmy Business Communication Company (BCC), całkowity światowy rynek produktów wytworzonych z zastosowaniem mikroorganizmów szacuje się na 306 mld USD (Microbial Products 2019). Zalety produkcji różnych związków z zastosowaniem mikroorganizmów w porównaniu do ich izolacji z organizmów roślin i zwierząt lub otrzymywania ich na drodze syntez chemicznych są następujące:

- 1) szybkie pobieranie składników odżywczych wspierających wysokie tempo metabolizmu i biosyntezy;
- 2) zdolność prowadzenia szerokiej gamy reakcji;
- 3) łatwość przystosowania się do wielu różnych środowisk;
- 4) łatwość manipulacji genetycznej, zarówno in vivo, jak i in vitro, w celu zwiększenia produkcji, modyfikacji struktur i procesów oraz tworzenia zupełnie nowych produktów;
- 5) prostota procedur przesiewowych;
- 6) duża różnorodność.

Produkty drobnoustrojów są bardzo zróżnicowane, począwszy od bardzo dużych cząsteczek, takich jak białka, kwasy nukleinowe, polimery węglowodanowe, a nawet komórki, do małych cząsteczek – metabolitów pierwotnych niezbędnych do ich wzrostu i metabolitów wtórnych, nieistotnych dla wzrostu.

Metabolity pierwotne to związki syntetyzowane przez mikroorganizmy, które są im potrzebne do wzrostu i przyrostu biomasy. Są one produkowane przez komórki mikroorganizmów zwykle jedynie w ilościach ściśle koniecznych do ich metabolizmu i genetycznie regulowanych procesów. Funkcjonalne geny, które determinują syntezę tych związków, wykazują aktywności tak długo, jak to konieczne, w zależności od cyklu życiowego oraz czynników środowiskowych. Poprzez zastosowanie mutacji, inżynierii genetycznej lub warunków hodowlanych, które spowodują zakłócenie procesów metabolicznych, można uzyskać większe ilości metabolitów pierwotnych. Większość z metabolitów pierwotnych uzyskuje się w procesach biotechnologicznych, np. kwasy organiczne, aminokwasy, nukleotydy, witaminy i prowitaminy, alkohole i rozpuszczalniki, polisacharydy, lipidy i enzymy.

Kwasy organiczne, takie jak octowy, propionowy, masłowy, szczawiowy, fumarowy, itakonowy, kwas cytrynowy, mlekowy, winowy, α-ketoglutarowy, glukonowy, 2-okso-D-glukonowy, 5-okso-D-glukonowy, 2,5-diokso-D-glukonowy, 2-okso-L-gulonowy, epoksy-bursztynowy, izoaskorbinowy i kojowy, są produkowane przez mikroorganizmy. Produkcja poszczególnych kwasów organicznych jest indywidualna dla każdego kwasu oraz mikroorganizmu stosowanego do jego produkcji. Celem pozyskania odpowiednich kwasów organicznych stosuje się odpowiednie gatunki należące do rodzaju Acetobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Aspergillus, Brevibacterium, Bacillus, Candida, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Gluconobacter, Hansenula, Kluyvera, Lactobacillus, Microbacterium, Pseudomonas, Paracolobacterium, Penicillium, Pichia, Propionibacterium, Proteus, Rhizopus, Serratia.

Aminokwasy: L-alanina, L-arginina, kwas L-asparaginowy, L-cytrulina, L-DOPA, kwas L-glutaminowy, L-histydyna, L-homoseryna, L-izoleucyna, L-leucyna, L-lizyna, L-ornityna, L-fenyloalanina, L- prolina, L-seryna, L-treo­nina, L-tryptofan, L-tyrozyna i L-walina produkuje się z wykorzystaniem organizmów należących do rodzaju Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Nocardia, Serratia, Arthrobacter, Streptomyces, Hansenula, Candida, Proteus i Aerobacter. Najczęściej aminokwasy otrzymuje się w hodowlach tlenowych zanurzonych, indywidualnych dla każdego organizmu i produkowanego aminokwasu. W wielu przypadkach szczepy należące do jednego gatunku produkują różne aminokwasy. Aminokwasy produkowane przez mikroorganizmy mają jedną formę izomeryczną. Mutanty bakterii Corynebacterium glutamicum i Brevibacterium flavum produkują ogromne ilości lizyny, wykorzystując do syntezy tego aminokwasu około jedną trzecią ilości węgla obecnego w podłożu.

Nukleotydy produkowane przemysłowo z zastosowaniem szczepów z rodzaju Micrococcus, Brevibacterium i Ba­cillus to głównie inozyno-5--mono­fosforan, guanozyno-5-monofosforan i ksantozyno-5-monofosforan. Nukleotydy te są stosowane w farmaceutyce oraz dodawane jako suplementy do żywności. Z kwasem glutaminowym dają efekt synergistyczny.

Witaminy i prowitaminy potrzebne mikroorganizmom mogą być przez nie syntetyzowane. Niektóre z nich są produkowane pozakomórkowo. Szczególne znaczenie mają mikroorganizmy produkujące witaminy B₁₂ (cyjanokobalamina), B₂ (ryboflawina, laktoflawina), ergosterol (prowitamina D₂) i β-karoten (prowitamina A), gdyż są jedynym ich źródłem w skali przemysłowej. Innym źródłem witamin są wątroba (B₁₂) oraz marchew (β-karoten). Komercyjne zastosowanie mają witaminy produkowane przez mikroorganizmy jak kwas pantotenowy, tiamina, kwas foliowy, kwas limonowy, witamina C i witamina K. Producentami witamin są szczepy z rodzaju Propionibacterium, Pseudomonas, Clostridium, Debaromyces, Candida, Ashby, Eromothecium, Streptomyces, Sporobolomyces, Bacillus i Chlorella. Prowitamina A (β-karoten) jest produkowana przez Choanephora, Blakeslea, Rhodotorula, Mycobacterium i Nocardia. Mutant Pseudomonas denitrificans może syntetyzować 50 000 razy więcej witaminy niż jego typ dziki. Ergosterol jest odzyskiwany z komórek drożdży.

Alkohole i rozpuszczalniki są produkowane w procesie fermentacji w warunkach beztlenowych. Ich produkcja na skalę przemysłową była stosowana jako pierwsza od XIX w. Pierwszym związkiem produkowanym przez mikroorganizmy na skalę przemysłową, wykorzystywanym następnie do produkcji syntetycznej skóry, był prawdopodobnie butanol. Obecnie na skalę przemysłową produkuje się butanol, aceton, butane-2,3-diol, glicerol, D-mannitol, D-arabitol, ksylitol, erytritol i dihydroksyaceton. Do ich produkcji wykorzystuje się szczepy z rodzaju Clostridium, Aerobacter, Serratia, Bacillus, Candida, Pichia, Monilia, Hansenula, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Acetobacter, Trigonopsis, Bacterium i Brevibacterium.

Polisacharydy są naturalnymi materiałami zapasowymi i składnikami roślin. Od 20 lat produkuje się je przemysłowo przy wykorzystaniu mikro­organizmów. Generalnie polisacharydy powodują wzrost lepkości w podłożach hodowlanych. Dziś na skalę przemysłową produkuje się pullulan, kurdlan, skleroglukan, dekstran, ksantan, bursztynyloglukan i alginian. Wykorzystuje się do tego szczepy należące do rodzaju Leuconostoc, Streptobacterium, Strepto­coccus, Xanthomonas, Aureobasidium, Dematium, Sclerotium, Plectania, Helotium, Alcaligenes, Pseudomonas, Azotobacter i Erwinia. Polisacharydy są szeroko stosowane w przemyśle spożywczym, w farmacji i medycynie, immunochemii, przemyśle tekstylnym, papierniczym, kosmetycznym i pasz dla zwierząt.

Lipidy produkowane przez mikroorganizmy są dodawane jako suplementy do karmy dla zwierząt. Mikroorganizmami produkującymi lipidy są grzyby pleśniowe i drożdże. Do produkcji lipidów zdolne są następujące gatunki drożdży: Candida curvata, Cryptococcus albidus, Cryptococcus curvatus, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Yarrowia lipolytica, grzyby strzępkowe: Aspergillus oryzae, Cunninghamella echinulata, Mucor mucedo, Rhizopus arrhizus, Mortierella isabellina, Mucor circinelloides, Pythium ultimum oraz bakterie: Arthrobacter sp., Acinetobacter calcoaceticus, Rhodococcus opacus i Bacillus alcalophilus.

Enzymy to klasa białek pozyskiwanych metodami biotechnologicznymi. Wykorzystuje się je w różnych gałęziach przemysłu. Są to amylazy, celulazy, pektynazy, lipazy, proteazy, inwertazy, oksydaza glukozowa, izomeraza glukozowa, dekstrancukraza, penicylinaza, katalaza, peroksydazy, monooksygenazy. W przemysłowej produkcji enzymów wykorzystuje się szczepy należące do rodzaju Trichoderma, Byssochlamys, Aspergillus, Penicillium, Botrytis, Bacillus, Rhizopus, Candida, Mucor, Nortierrella, Clostridium, Saccharomyces, Streptomyces, Leuconostoc i Actinomyces.

2.2.2. Metabolity wtórne

Metabolity wtórne są produkowane przez żywe komórki, lecz nie są absolutnie konieczne do ich wzrostu i przyrostu biomasy. Mają małą masę cząsteczkową. Należą do nich antybiotyki, roślinne hormony wzrostu, alkaloidy, toksyny oraz pewne niezwykłe aminokwasy. Znanych jest więcej niż 6000 metabolitów produkowanych przez mikroorganizmy, ale marketingowe znaczenie ma jedynie około 100 z nich. Ich chemiczna struktura oraz trudne do zidentyfikowania funkcje odbiegają od metabolitów pierwotnych. Produkcja oraz szybkość pozyskiwania metabolitów wtórnych zależą od cyklu rozwojowego mikroorganizmu (od kilkudziesięciu minut do kilku dni w warunkach laboratoryjnych). Wytwarza się je nie tylko w bardzo małych ilościach. W tabeli 2.1 przedstawiono przykładowe grupy metabolitów wtórnych biologicznie aktywnych produkowane przez mikroorganizmy.

Antybiotyki są wykorzystywane głównie jako dodatki do pasz dla zwierząt oraz w medycynie do zabijania mikroorganizmów patogenicznych. Ponad połowa antybiotyków jest produkowana przez promieniowce, szczególnie przez Streptomyces, niektóre grzyby, jak Penicillium, Aspergillus, Trichoderma i Fusarium, oraz pewne Basidiomycota.

Ze względu na strukturę cząsteczki wyróżnia się następujące typy antybiotyków:

- 1) β-laktamowe (penicyliny i cefalosporyny);
- 2) polipeptydy (gramicydyny A, B, C i S, tyrocidyna, polimyksyna, bacytracyna itp.);
- 3) aminoglikozydy (streptomycyna, neomycyna, gentamycyna, kanamycyna, streptydyna);
- 4) makrolidowe (erytromycyna , klarytromycyna, azytromycyna, josamycyna, spiromycyna i roksatromycyna itp.);
- 5) związki chinonowe (tetracyklina, emodyna, islandycyna itp.);
- 6) z aromatycznymi pierścieniami (chloramfenikol, gryzeofulwina, nowobiocyna);
- 7) o różnej strukturze niezaliczane do ww. grup (mitomycyna, aktynocycyna, puromycyna itp.).

Pewne związki produkowane przez mikroorganizmy uważane za miko­toksyny jak patulina lub zearaleon są podobne do takich antybiotyków jak emodyna i islandycyna.

Hormony steroidowe są produkowane przez niektóre grzyby strzępkowe, a hormony roślinne jak gibereliny – przez Gibberella fujikuroi. Powstają one na drodze konwersji substancji znajdujących się w środowisku.

Tabela 2.1. Aktywność biologiczna pewnych metabolitów wtórnych produkowanych przez mikroorganizmy przemysłowo istotne

+------------------------+---------------------+--------------------------------+
| Substancje aktywne | Przykłady | Mikroorganizm |
+------------------------+---------------------+--------------------------------+
| antybakteryjne | cefalosporyna | Acremonium chrysogenum |
| | | |
| | cefamycyna | Saccharopolyspora erythraea |
| | | |
| | chloramfenikol | Streptomyces kanamyceticus |
| | | |
| | erytromycyna | Streptomyces aureofaciens |
| | | |
| | kenamycyna | Streptomyces clavuligerus |
| | | |
| | penicylina | Penicillium chrysogenum |
| | | |
| | ryfamycyna | Amycolatopsis mediterranei |
| | | |
| | spektynomycyna | Streptomyces spectabilis |
| | | |
| | streptomycyna | Streptomyces griseus |
| | | |
| | tetracyklina | Streptomyces venezuelae |
+------------------------+---------------------+--------------------------------+
| antygrzybicze | amfoterycyna | Streptomyces nodosus |
| | | |
| | aureofacyna | Streptomyces aureofaciens |
| | | |
| | griseofulwina | Penicillium griseofulvum |
| | | |
| | kandycidyna | Streptomyces griseus |
| | | |
| | kwas aspergilowy | Aspergillus flavus |
| | | |
| | nystatyna | Streptomyces nourse |
| | | |
| | oligomycyna | Streptomyces diastachromogenes |
+------------------------+---------------------+--------------------------------+
| inhibitory enzymów | kwas klawulanowy | Streptomyces clavuligerus |
+------------------------+---------------------+--------------------------------+
| immunosupresory | cyklosporyna A | Tolypocladium inflatum |
| | | |
| | rapamycyna | Streptomyces hygroscopicus |
| | | |
| | takrolimus (FK-506) | Streptomyces spp. |
+------------------------+---------------------+--------------------------------+
| antyrakowe | aktynomycyna D | Streptomyces antibioticus |
| | | |
| | bleomycyna | Streptomyces verticillus |
| | | |
| | doksarubicyna | Streptomyces peucetius |
| | | |
| | mitomycyna | Streptomyces lavendulae |
| | | |
| | taksol | Taxomyces andreanae |
+------------------------+---------------------+--------------------------------+
| antycholesterolowe | lowastatyna | Aspergillus terreus |
| | | |
| | monakolina | Monascus ruber |
| | | |
| | prawastatyna | Penicillium citrinum |
+------------------------+---------------------+--------------------------------+
| promotory wzrostu | monensyna | Streptomyces cinnamonensis |
| | | |
| | tylozyna | Streptomyces fradiae |
+------------------------+---------------------+--------------------------------+
| hormony wzrostu roślin | giberelina | Gibberella fujikuroi |
+------------------------+---------------------+--------------------------------+
| herbicydy | bialafos | Streptomyces hygroscopicus |
+------------------------+---------------------+--------------------------------+
| insektycydy | awermektyna | Streptomyces avermitilis |
| | | |
| | milbemycyna | Streptomyces hygroscopicus |
+------------------------+---------------------+--------------------------------+

Toksyny są wydzielane przez niektóre mikroorganizmy jako substancje szkodliwe, w szczególności skierowane przeciwko organizmom stałocieplnym, ale pewne z nich mogą być wykorzystywane w farmacji i medycynie w małych ilościach jako antygeny, szczepionki albo antytoksyny. Na przykład alkaloidy wytwarzane przez Claviceps purpurea są produkowane i wykorzystywane w medycynie, natomiast aflatoksyn produkowanych przez Aspergillus flavus należy unikać. Niektóre toksyny wykorzystuje się jako bioinsektycydy. Toksyny są produkowane przez bakterie: Corynebacterium diphtheriae, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Vibrio cholerae, Salmonella, Bacillus thuringiensis oraz grzyby: Aspergillus i Claviceps.

Niezwykłe aminokwasy w żywym organizmie to takie, które (oprócz β-alaniny) mają inną strukturę niż α-aminokwasy lub mają dodatkową grupę funkcyjną. Aminokwasy te mogą znajdować się w komórkach mikroorganiz­mów zarówno w postaci wolnej, jak i być zawarte w peptydzie. Do tej pory zidentyfikowano ponad 100 aminokwasów. Są to izomeryczne formy D-aminokwasów. Tworząc polipeptydy, często występują one w strukturach polisacharydowych produkowanych przez mikroorganizmy. Niektóre z nich występują w postaci wolnych aminokwasów, di- lub tripeptydów, różnych związków toksycznych lub pełnią rolę antybiotyku, jak azaseryna, azaleucyna, alanozyna, kwas diaminobursztynowy, DON (6-diazo-5-okso-L-norleucyna) i tabtoksyna.

2.3.Mikroorganizmy stosowane w mikrobiologii przemysłowej

2.3.1. Bakterie

W mikrobiologii przemysłowej są powszechnie stosowane trzy grupy organiz­mów: bakterie, drożdże i grzyby strzępkowe.

Bakterie są wykorzystywane do produkcji metabolitów pierwotnych i wtórnych. Są również stosowane jako komórkowe fabryki do wytwarzania somatostatyny, insuliny, bydlęcego hormonu wzrostu wykorzystywanych w weterynarii, α-1 antytrypsyny, interleukiny-2, czynnika martwicy nowotworów, β-interferonu i γ-interferonu. Escherichia coli jest jednym z najwcześniej i najczęściej stosowanych bakterii do produkcji białek heterologicznych. Już w 1993 r. zrekombinowane procesy Escherichia coli dostarczyły produktów metabolicznych o wartości prawie 5 mld dolarów, tj. insuliny, ludzkiego hormonu wzrostu, interferonów i G-CSF. Do zalet Escherichia coli należą szybki wzrost, szybka ekspresja, łatwość hodowli i modyfikacji genomu, niski koszt i wysoka wydajność produktu. Służy on do masowej produkcji wielu skomercjalizowanych białek, jest doskonały do funkcjonalnej ekspresji białek nieglikozylowanych.

Genetyka Escherichia coli jest znacznie lepiej poznana niż innych mikroorganizmów. Ostatnie postępy w fundamentalnym rozumieniu transkrypcji, translacji i zwijania białek w Escherichia coli, wraz z dostępnością ulepszonych narzędzi genetycznych, czynią tę bakterię bardziej wartościową niż kiedykolwiek w ekspresji złożonych białek eukariotycznych. Jej genom można szybko i precyzyjnie z łatwością modyfikować, kontrola promotora nie jest trudna, a liczba kopii plazmidu może być łatwo zmieniona. System ten charakteryzuje się również zmianą metabolicznego przepływu węgla w zależności od potrzeb, unikaniem wbudowywania analogów aminokwasów, tworzeniem wewnątrzkomórkowych wiązań disiarczkowych i odtwarzalną wydajnością przy kontroli komputerowej. Escherichia coli może gromadzić białka rekombinowane do 80% suchej masy i przetrwać różne warunki środowiskowe. Produkcja rekombinowanego białka w Escherichia coli może być zwiększona przez mutacje, które eliminują wytwarzanie octanu.

Bakterie z rodzaju Bacillus (zazwyczaj Bacillus megaterium, Bacillus subtilis i Bacillus brevis) osiągają wydajność produkcji białek ssaków sięgającą 3 g/l. Staphylococcus carnosus może wytwarzać 2 g/l wydzielanego białka ssaków. Ulepszony producent z bakterii Gram-ujemnych do produkcji białka rekombinowanego został skonstruowany przy użyciu szczepu Ralstonia eutropha. Pod względem tworzenia inkluzji układ ten okazał się lepszy od Escherichia coli. Organofosfohydrolaza, białko podatne na tworzenie inkluzji produkowane w ilości mniejszej niż 100 mg/l przez Escherichia coli, zostało wytworzone w ilości 10 g/l przez Ralstonia eutropha. Inną użyteczną bakterią jest Pseudomonas fluorescens MB101. Ten system wytworzył 4 g/l TNF-α (czynnika martwicy nowotworów).

2.3.2. Drożdże

Drożdże to jednokomórkowe organizmy grzybów eukariotycznych. Często stosuje się je do wytwarzania białek rekombinowanych, których nie wytwarzają dostatecznie dobrze komórki Escherichia coli z powodu problemów z ich składaniem lub potrzebą glikozylacji. Główne zalety układów ekspresyjnych drożdży to:

- 1) stabilność genetyczna szczepów produkcyjnych;
- 2) prowadzenie procesu glikozylacji białek;
- 3) składanie białek;
- 4) produkcja białek bogatych w S–S;
- 5) obfity wzrost komórek (wydajność g/l oraz plon komórkowy g/g substratu);
- 6) szybki wzrost na zdefiniowanych podłożach;
- 7) obróbka produktu podobna do takiej jak w komórkach ssaków.

Szczepy drożdży są dobrze scharakteryzowane genetycznie. Wiadomo, że dokonują wielu potranslacyjnych modyfikacji syntetyzowanych białek. Są łatwiejsze i tańsze w badaniach i ich zastosowaniu przemysłowym niż komórki owadów lub ssaków i łatwo przystosowują się do warunków fermentacji.

Dwa najczęściej wykorzystywane szczepy drożdży to Saccharomyces cerevisiae i drożdże metylotroficzne Pichia pastoris. Oksydaza glukozowa z Aspergillus niger jest produkowana przez Saccharomyces cerevisiae z wydajnością 9 g/l. Rekombinowane produkty dostępne na rynku wytwarzane przez Saccharomyces cerevisiae to insulina, antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, oksydaza moczanowa, glukagony, czynnik stymulujący kolonizację makrofagów granulocytów (GM-CSF), hirudyna i płytkowy czynnik wzrostu.

Pichia pastoris wykazują silny wzrost oraz indukowaną metanolem ekspresję i sekrecję rekombinowanych białek. Są stosowane do komercyjnej produkcji nieglikozylowanej albuminy surowicy ludzkiej i glikozylowanych szczepionek. Skonstruowano szczepy zdolne do N-glikozylacji typu ludzkiego, a produkty są już w fazie testów klinicznych. Wysokie wydajności białka rekombinowanego można uzyskać za pomocą Pichia pastoris (10 g/l czynnika powodującego martwicę nowotworu, 14,8 g/l żelatyny, 15 g/l mysiego kolagenu, fitazy Escherichia coli i 6 g/l lipazy/acetylotransferazy oraz 6 g/l genu Candida parapsilosis). Białka bakteryjne, takie jak wewnątrzkomórkowy fragment tężcowy C, można wytwarzać z wydajnością 12g/l. Albumina surowicy była produkowana przez Saccharomyces cerevisiae z wydajnością 0,15 g/l, a Pichia pastoris produkuje ją w ilości 10 g/l. Mówi się, że Pichia pastoris może wytworzyć 20–30 g/l rekombinowanych białek. Heterologiczna ekspresja genu u innego gatunku metylotroficznych drożdży Hansenula polymorpha spowodowała produkcję 13,5 g/l fitazy, a innych białek – powyżej 10 g/l. Do zalet drożdży metylotroficznych w porównaniu z Saccharomyces cerevisiae jako gospodarzem klonującym należą:

1. 1) wyższa produktywność białka;
2. 2) unikanie hiperglikozylacji;
3. 3) wzrost przy takich stężeniach metanolu, które zabijają większość innych mikroorganizmów;
4. 4) tania eksploatacja systemu;
5. 5) integracja wielokopii obcego DNA do chromosomalnego DNA, dającego stabilne transformanty.

2.3.3. Grzyby strzępkowe

Grzyby strzępkowe są atrakcyjnymi gospodarzami technologii rekombinacji DNA ze względu na zdolność do wydzielania dużych ilości bioaktywnych białek z przetwarzaniem posttranslacyjnym, takim jak glikozylacja. Aspergillus niger produkuje 25 g/l natywnej glukoamylazy. Obce geny można włączyć przez plazmidy do chromosomów grzybów strzępkowych, gdzie stabilnie integrują się z chromosomem jako powtórzenia tandemowe zapewniające doskonałą długoterminową stabilność genetyczną. Podobnie jak komórki ssaków, grzyby posiadają system komórkowy do translacji białek, fałdowania białek i modyfikacji posttranslacyjnej. Podobnie jak bakterie, grzyby strzępkowe są łatwe w hodowli na podłożach zdefiniowanych. Rozwój genetyczny Aspergillus obejmuje:

1. 1) układy transformacyjne;
2. 2) konstrukty ekspresyjne;
3. 3) ukierunkowaną integrację i manipulację liczbą kopii;
4. 4) promotory;
5. 5) ulepszone projektowanie genów;
6. 6) inżynierię proteaz, wydzielanie i glikozylację;
7. 7) narzędzia do znakowania i wyciszania genów.

1000-krotny wzrost produkcji fitazy osiągnięto w hodowlach Aspergillus niger dzięki zastosowaniu technologii rekombinacji. Rekombinowany Aspergillus oryzae może wytworzyć 2 g/l ludzkiej laktoferyny, a Mucor – 3,3 g/l reniny. Produkcja ludzkiej laktoferyny przez Aspergillus awamori za pośrednictwem technologii rDNA wzrosła do 2 g/l białka zewnątrzkomórkowego. Glukoamylaza Aspergillus niger wklonowana do Aspergillus awamori była produkowana z wydajnością 4,6 g/l. Grzyb Chrysosporium lucknowense został genetycznie przekształcony w niestrzępkowy, mniej lepki szczep wytwarzający małe ilości proteazy, który jest zdolny do wytwarzania bardzo dużych ilości białek heterologicznych. Dyadic International, Inc., firma zajmująca się rozwojem systemu Chrysosporium lucknowense uzyskuje produkcję natywnego białka zewnątrzkomórkowego do 100 g/l.

2.4.Izolacja mikroorganizmów przemysłowych

Mikroorganizmy przemysłowe są z wielu powodów bardzo wygodne do stosowania, zwłaszcza dla inżynierii genetycznej i metabolicznej. Wyekstrahowane z komórek mikroorganizmów przemysłowych łańcuchy DNA mogą być łatwo pocięte przez enzymy restrykcyjne produkowane przez różne inne mikroorganizmy, tworząc odpowiednie fragmenty DNA. Z kolei małe fragmenty DNA można połączyć w cząsteczki DNA wektora za pomocą ligazy DNA, tworząc sztuczne cząsteczki DNA. Wektory można łatwo wprowadzić do gospodarza, którym mogą być wirusy lub bakterie. Są one replikonami, które mogą istnieć w stanie pozachromosomalnym, mogą być przenoszone drogą transdukcji i transformacji. Łatwa jest także ostateczna charakterystyka rekombinowanego klonu.

Strategie przyjęte do izolacji odpowiedniego mikroorganizmu przemysłowego ze środowiska naturalnego można podzielić na dwa typy shotgun i racjonalne (obiektywne). Strategie typu shotgun polegają na tym, że próbki żywych mikroorganizmów zbiera się z biofilmów, materiału zwierzęcego i roślinnego, gleby, ścieków, wody i strumieni odpadów, a także ze środowisk skrajnych oraz niezwykłych siedlisk stworzonych przez człowieka. Następnie bada się je pod kątem pożądanych cech. Bardziej racjonalne (obiektywne) jest pobieranie próbek z określonych miejsc, w których składnikami naturalnej mikroflory są prawdopodobnie organizmy o pożądanych właściwościach. Na przykład mikroorganizm, który degraduje lub transformuje jakiś związek chemiczny, przez co czyni go nieszkodliwym dla środowiska, będzie prawdopodobnie obecny w miejscach zanieczyszczonych tym związkiem. Zatem należy go tam właśnie szukać, a następnie pobrać i wyizolować.

Po pobraniu próbek poważnym problemem jest wybranie właściwego podłoża hodowlanego i warunków hodowli, które należy zastosować do wyizolowania docelowego mikroorganizmu czy mikroorganizmów. W tym celu najczęściej zabija się lub hamuje wzrost organizmów powszechnie występujących w środowisku, a promuje do wzrostu mikroorganizmy rzadkie, niepoznane, o szczególnych cechach. Można także stosować hodowle okresowe namnażające, wzbogacające w populacje bardzo rzadkie lub prowadzić hodowle ciągłe sprzyjające namnażaniu się różnych mikroorganizmów. Sprzyjające warunki zachęcają do wzrostu organizmy docelowe o pożądanych cechach i zwiększają ich ilość przed izolacją i badaniem przesiewowym. Jednakże ten sposób selekcji jest odpowiedni tylko wówczas, gdy pożądana cecha zapewnia przewagę konkurencyjną organizmom. Stosuje się wiele rodzajów podłoży, ale nie ma takiego, które byłoby odpowiednie dla wszystkich mikroorganizmów. Na przykład, jeśli bakterie z próby gleby zostaną wysiane na agar odżywczy (pH 7,0) i inkubowane w temp. 37°C przez 24−48 godz. wyrośnie jedna frakcja tlenowych mezofilnych bakterii. Zgubione zostaną beztlenowce, termofile, alkalifile i acydofile. Powolny wzrost mezo­fili jak Actinomycetes, a także patogennych mezofili nie jest możliwy na agarze odżywczym. Jeśli wyrośnie mikroorganizm wydzielający substancje antybakteryjne, uniemożliwi wzrost pewnych bakterii mezofilnych. W celu zahamowania wzrostu grzybów do podłoża dodaje się antygrzybowy czynnik (cykloheksamid i nystatynę w stężeniu 50−100 µg/ml). Do izolacji bakterii Gram-ujemnych stosuje się agar MacConkeya zawierający sole kwasów żółciowych, które hamują wzrost bakterii Gram-dodatnich. Do izolacji bakterii sporujących próby przed wysiewem podgrzewa się do temp. 70°C przez 10−15 min w celu zabicia form wegetatywnych i wysiewa je na podłoże M-9 z różnymi źródłami węgla. Bakterie tworzące strzępki rosną na podłożach powoli. Najliczniej występują w glebach rolniczych. Ich liczebność jest największa w sezonie suchym, a znacznie mniejsza w deszczowym. Gleba powietrznie wysuszona przez kilka dni jest idealna do selekcji Actinomycetes. Ta grupa bakterii rozwija się najlepiej na podłożu zawierającym argininę i glicerol. Ponadto dodaje się do niego chloramfenikol (50 µg/ml), nystatynę (50 µg/ml), polimyksynę (50 µg/ml) i penicylinę (100 µg/ml) w celu zahamowania wzrostu grzybów i innych bakterii.

Grzyby są bardzo różnorodne i mają różne wymagania pokarmowe. Podłoże zawierające substancje odżywcze powinno być wzbogacone w związki antybakteryjne, jak penicylinę, streptomycynę, chloramfenikol, kanamycynę i tetracyklinę, w celu zahamowania wzrostu bakterii. Do izolacji grzybów najczęściej stosuje się podłoże PDA (Potato Dextrose Agar) oraz podłoże z różem bengalskim.

Izolacja następcza na odpowiednich podłożach selekcyjnych i w określonych warunkach wzrostu prowadzi do pozyskiwania czystych szczepów rosnących na zestalonym podłożu wzrostowym. Po wyizolowaniu czystych szczepów, każdy z nich musi być poddany badaniom przesiewowym pod kątem pożądanej właściwości, produkcji specyficznych enzymów czy produkcji związków inhibitorowych. Jednak na tym etapie poziom aktywności lub stężenia produktu nie ma większego znaczenia, ponieważ rozwój szczepu można ulepszać różnymi technikami, aby doprowadzić do znacznej poprawy jego wydajności. Wybrane izolaty muszą być również badane pod kątem takich ważnych cech, jak stabilność szczepu oraz, w razie potrzeby, nietoksyczność.

Procedury izolacji i badań przesiewowych są łatwiejsze do zastosowania w poszukiwaniu pojedynczego mikroorganizmu. Znacznie trudniej jest wyodrębnić konsorcja, które razem wykazują poszukiwaną zdolność/charakterystykę i których skład może się zmieniać w czasie. Takie grupy mogą być bardziej wydajne, zwłaszcza tam, gdzie chodzi o zdolność do degradacji złożonego związku, opornego na ataki pojedynczych organizmów.

2.5.Ważniejsze kolekcje szczepów

Na całym świecie istnieje prawie 500 kolekcji mikroorganizmów, w większości niewielkich lub sprofilowanych, które dostarczają odpłatnie pożądanych szczepów lub świadczą inne powiązane usługi objęte porozumieniem. I tak w Wielkiej Brytanii istnieje UKNCC składająca się z kilku kolekcji trzymanych w różnych instytucjach specjalizujących się w kolekcjach bakterii, drożdży, grzybów strzępkowych lub glonów o znaczeniu przemysłowym lub medycznym. W USA istnieje kolekcja scentralizowana American Type Culture Collection (ATCC), która przechowuje wszystkie rodzaje mikroorganizmów. Warto nadmienić, że na długiej liście różnych kolekcji nie ma kolekcji polskich. Szczepy stosowane w badaniach znajdują się w laboratoriach Zakładów Naukowych: Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Wydziału Chemii i Technologii Żywności Politechniki Łódzkiej, Akademii Techniczno-Ekonomicznej we Wrocławiu, Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Instytutu Przemysłu Mleczarskiego w Warszawie, Uniwersytetu Adama Mickiewicza, Uniwersytetu Jagiellońskiego. Listę największych kolekcji mikroorganizmów przedstawiono w tabeli 2.2.

W sumie we wszystkich kolekcjach Global Catalogue of Microorganisms w 2019 r. znajdowały się 232 gatunki (580 szczepów) Cyanobacteria, 20 797 gatunków (145 963 szczepy) Bacteria, 1422 gatunki (3442 szczepy) Archaea, 29 290 gatunków (226 152 szczepy) grzybów, 4435 gatunków (15 144 szczepy) glonów, 33 gatunki (296 szczepów) wirusów, 299 gatunków (456 szczepów) fagów, 2030 plazmidów, 238 gatunków (755 szczepów) Protozoa oraz 1833 gatunki (7428 szczepów) innych organizmów. Łącznie w GCM znajduje się 54 736 gatunków (447 512 szczepów) mikroorganizmów.

Najliczniejsze są szczepy związane z człowiekiem, roślinami oraz występujące w próbkach gleby (tab. 2.3).

Tabela 2.2. Lista największych kolekcji mikroorganizmów

Lp. Akronim Nazwa instytucji Kraj Adres internetowy
----- --------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------- ------------------------------------
1 ATCC American Type Culture Collection USA www.atcc.org/
2 BCRC Bioresource Collection and Research Center/Food Industry Research and Development Institute Chiny Taipei www.bcrc.firdi.org.tw
3 CAIM Collection of Aquatic Important Microorganisms/CIAD/Mazatlán Unit for Aquaculture and Environmental Management Meksyk www.ciad.mx/caim
4 CCM Czech Collection of Microorganisms/Masaryk University Czech Czechy http://sci.muni.cz/ccm/index.html
5 CCUG Culture Collection University of Gothenburg Szwecja www.ccug.se
6 CECT Spanish Type Culture Collection/University of Valencia Hiszpania www.cect.org
7 CGMCC China General Microbiological Culture Collection Center Chiny www.cgmcc.net
8 CICC China Center of Industrial Culture Collection Chiny www.china-cicc.org
9 CIP Collection de l’Institut Pasteur Francja https://catalogue-crbip.pasteur.fr
10 ICMP International Collection of Microorganisms from Plants Nowa Zelandia www.landcareresearch.co.nz/icmp
11 JCM Japan Collection of Microorganisms/RIKEN BioResource Research Center Japonia http://icm.brc.rike.jp/
12 KCTC Korean Collection for Type Cultures, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Korea http://kctc.kribb.re.kr
13 KMM G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far-Eastern Branch, Russian Academy of Sciences Rosja niedostępny
14 NBRC Biological Resource Center/National Institute of Technology and Evaluation Japonia www.nite.go.jp/en/nbrc/index.html
15 NCAIM National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms Węgry http://ncaim.uni-corvinus.hu/
16 NCTC National Collection of Type Cultures Anglia www.pheculturecollections.org.uk/
17 PCU Pharmaceutical Sciences Chulalongkorn University Culture Collection/Chulalongkorn University Tajlandia niedostępny
18 TBRC Thailand Bioresource Research Center/National Center for Genetic Engineering and Biotechnology Tajlandia www.tbrcnetwork.org
19 TISTR TISTR Culture Collection/Bangkok MIRCEN Tajlandia www.tistr.or.th/tistr_culture
20 VKM All-Russian Collection of Microorganisms Rosja http://www.vkm.ru/