Spektrometria ICP-MS - ebook

AUTORZY

prof. dr hab. Marcin Frankowski, Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu

dr inż. Rafał Głaszczka, Shim-Pol A.M. Borzymowski, Warszawa

mgr Andrzej Reszka, Shim-Pol A.M. Borzymowski, Warszawa

prof. dr hab. Marek Szklarczyk, Shim-Pol A.M. Borzymowski, Warszawa

dr inż. Sebastian Szopa, Shim-Pol A.M. Borzymowski, Warszawa

dr Szymon Wojtyła, Shim-Pol A.M. Borzymowski, Warszawa

prof. UAM, dr hab. Anetta Zioła-Frankowska, Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w PoznaniuROZDZIAŁ 1
WPROWADZENIE – NIECO HISTORII I NIECO PODSTAW SPEKTROMETRII MAS
MAREK SZKLARCZYK

1.1.
Nieco historii

Przełom wieków XIX i XX to okres burzliwego rozwoju fizyki i chemii prowadzący do sformułowania wielu teorii będących podstawą nowoczesnych fizykochemicznych metod analitycznych. Dzięki postępowi nauki w tym okresie możliwe staje się zaprojektowanie wielu nowych rozwiązań w dziedzinie spektroskopii, spektrometrii, chromatografii i mikroskopii. Druga połowa XX wieku to wręcz lawinowy rozwój produkcji aparatury analitycznej umożliwiającej analizę składu chemicznego na niespotykanie niskim dotąd poziomie stężeń, femtomoli (10–15) – spektrometria mas, MS, czy też attomoli (10–18) – spektrometria MALDI-TOF. Krokiem milowym w tym okresie było wprowadzenie spektroskopii fotoelektronów (XPS), techniki umożliwiającej równoczesne określanie pierwiastkowego składu chemicznego i rodzaju wiązań pomiędzy pierwiastkami znajdującymi się w próbkach zarówno na ich powierzchni, jak i w głębi, i to bez konieczności ich rozpuszczania. Te wielkie postępy umożliwiły prawie pełną analizę zarówno jakościową, jak i ilościową. Drugi rodzaj analizy przeżywającej również burzliwy rozwój w drugiej połowie XX wieku to różnego rodzaju mikroskopie. W tym okresie możliwe stało się obrazowanie pojedynczych atomów (mikroskopia tunelowania, STM, mikroskopia sił atomowych, AFM, wysokorozdzielcza mikroskopia elektronowa, HREM).

Wraz z rozwojem nauki, techniki i technologii, a przede wszystkim zapotrzebowaniem społecznym na informacje o dostępnych produktach i otaczającym nas środowisku w końcu XX wieku pojawiło się zapotrzebowanie nie tylko na techniki umożliwiające doskonałe badania strukturalne, oznaczania jakościowe i ilościowe, ale również na techniki pozwalające na przestrzenne umiejscowienie oznaczanych substancji, co również umożliwiają między innymi techniki analizy mas takie jak MALDI-TOF oraz ablacja laserowa (LA) sprzęgnięta z aparatem ICP-MS.

Detekcja mas jest też nieodłączną częścią składową analitycznych metod sprzężonych i wielowymiarowych umożliwiających oznaczanie zarówno jakościowe, jak i ilościowe związków wysoce podobnych, izomerów bądź też znajdujących się w tzw. trudnych matrycach. Metody te to na przykład tzw. techniki kompleksowe; GC×GC-MS, czy też LC×LC-MS, dwuwymiarowa technika MDGC, techniki będące połączeniem różnych technik analitycznych, na przykład LC-GC-MS czy też LC-ICP-MS. Jednym z najnowszych rozwiązań łączenia technik w jednym zestawie analitycznym jest połączenie spektroskopii mas z mikroskopią fluorescencyjną i laserową jonizacją próbki (MF-MALDI-MSn ≤10-TOF) oraz połączenie techniki ablacji laserowej z techniką jonizacji w plazmie (LA-ICP-MSn). Techniki te są coraz szerzej stosowane w różnych dziedzinach, od farmakologii i farmakoterapii do diagnozy chorób cywilizacyjnych (fNIRS – functional Near Infrared Spectroscopy.

Dążenie do oznaczenia masy atomowej/cząsteczkowej nieznanych substancji zasadniczo towarzyszyło ludzkości od momentu zainteresowania przyrodą na skalę mikro. Wiek XIX można by uznać za początek nowożytnego podejścia do tego zagadnienia. W 1815 roku William Prout zaproponował, że każdy typ atomu ma określoną masę zwaną wówczas masą atomową. Ustalił on, że masa atomów niektórych pierwiastków chemicznych jest całkowitą wielokrotnością masy atomu wodoru, jednak późniejsze i dokładniejsze pomiary Jönsa Jakoba Berzeliusa w 1828 roku i Edwarda Turnera w 1832 roku zdawały się obalać tę hipotezę. J.J. Berzelius wyznaczył masę atomu chloru jako 35,45 razy większą od masy wodoru, czyli wielokrotność ułamkową. Jeszcze w roku 1886 Sir William Crookes, angielski fizyk i chemik, popierał hipotezę W. Prouta. Uznał on całkowite wartości liczbowe mas atomowych pierwiastków, jednocześnie wątpiąc w jednostkową wartość masy atomowej każdego z atomów. Tłumaczył to tym, że prawdopodobnie masy atomowe wyznaczane w eksperymentach reprezentują wartość średnią, wokół której rzeczywiste masy atomu różnią się w pewnych wąskich granicach. W ten sposób dało się wytłumaczyć masy atomowe takich pierwiastków jak chlor. Sugestia zawarta w wyjaśnieniu W. Crookesa okazała się prorocza, ale na jej uzasadnienie trzeba było poczekać do czasu prac Fredericka Soddy’ego, które dotyczyły istnienia izotopów (lata 1911–1913), i zasadniczo ten okres można uznać za początki obecnej spektrometrii mas.

Rys. 1.1. Jeden z modeli spektrometru mas autorstwa J.J. Thomsona, https://de.wikipedia.org

Procesy jonizacji, nieodłączny etap spektrometrii mas, zostały zaobserwowane i opisane już w drugiej połowie XIX wieku. Najpierw, w 1859 roku Julius Plücker zaobserwował wpływ pól magnetycznych na jarzenie lamp wyładowczych, czyli w rurce szklanej wypełnionej gazem i zawierającej anodę i katodę. W 1886 roku Eugen Goldstein opublikował artykuł o strumieniu jonów dodatnich, nazywając je promieniowaniem kanalikowym. Nazwa promieniowanie kanalikowe wzięła się stąd, że powstające poza katodą promieniowanie dodatnie było przyspieszane w drodze do katody, w której znajdowały się otwory – kanaliki. Promieniowanie to po przejściu przez katodę wywoływało luminescencję w znajdującym się za nią szkle.

J.J. Thomson w 1887 roku doświadczalnie potwierdził istnienie elektronu, wyznaczając jego stosunek masy m do ładunku z, czyli m/z – podstawowy parametr w spektrometrii mas. W 1898 roku Wilhelm Wien, odchylając promienie anodowe w silnym polu magnetycznym, zauważył rozdzielenie wiązki jonów, co wytłumaczył różnicami w masie jonów. Późniejsze badania nad promieniami anodowymi, prowadzone przez W. Wiena oraz J. J. Thomsona, doprowadziły do wyznaczenia stosunku ładunku do masy (m/z) wielu jonów, a tym samym do fizycznego wyznaczenia mas atomów; dalsze prace doprowadziły do powstania i rozwoju spektrometrii mas.

J.J. Thomson w roku 1912 skonstruował spektrograf nazwany parabolicznym (rys. 1.1) do badania odchylenia torów jonów w polu magnetycznym i elektrycznym, a pierwszymi widmami były widma gazów, w tym pierwiastkowych, N₂, O₂, CO, CO₂ i COCl₂ (fosgen). Za pomocą swego aparatu J.J. Thomson w roku 1913 udowodnił doświadczalnie istnienie izotopów atomu neonu, pokazując dwie linie jego izotopów, ²⁰Ne i ²² Ne, co dwa lata wcześniej przewidział Frederick Soddy (1911 r.). I wojna światowa bardzo spowolniła prace nad rozwojem oznaczania wartości mas. Dopiero w 1919 roku F.W. Aston zaprezentował kolejną konstrukcję aparaturową przeznaczoną do badań składu izotopowego. Ta nowa konstrukcja została nazwana spektrografem masowym. W Stanach Zjednoczonych badaniami nad wyznaczaniem stosunku m/z zajmował się Arthur Jeffrey Dempster (1886–1950), który badał magnez. W 1918 roku zaprezentował on swój pierwszy przyrząd około 100 razy dokładniejszy niż dotychczasowe, a którego wiele elementów stosowanych jest do dzisiaj. Dla tego przyrządu po raz pierwszy użyto nazwy spektrometr mas. Można też stwierdzić, że A.J. Dempster jest w pewnym sensie również ojcem bomby atomowej, ponieważ w czasie swoich badań z wykorzystaniem spektrometru mas w 1935 roku zidentyfikował izotop uranu ²³⁵U, co w ciągu około dziesięciu lat doprowadziło do skonstruowania bomby atomowej. Prace Dempstera zasadniczo zakończyły pierwszy okres rozwoju spektrometrii mas, w którym głównym celem było oznaczenie dokładnej masy izotopów pierwiastków.

Badania Anglików J. J. Thomsona (1856–1940) i jego asystenta F.W. Astona (1877–1945) zostały uhonorowane nagrodami Nobla (J.J. Thomson, 1906 r., F.W. Aston, 1922 r.).

Metoda spektrometrii mas gwałtownie zaczęła się rozwijać od lat 40. ubiegłego wieku. Czynnikiem wpływającym na rozwój były osiągnięcia w technice próżniowej koniecznej do prawidłowego działania spektrometru mas. Thomson i Aston używali ręcznie napędzanej pompy rtęciowej. W latach 1909–1916 Irving Langmuir znacznie udoskonalił techniki pompowania i skonstruował pompę dyfuzyjną, a już w 1912 roku Wolfgang Gaede skonstruował pierwszą pompę molekularną znacznie udoskonaloną przez M. Siegbahna (1926 r.) późniejszego laureata nagrody Nobla za osiągnięcia w dziedzinie spektroskopii fotoelektronów, XPS. W roku 1957 W. Becker przedstawił nowe rozwiązanie w tej dziedzinie nazwane pompą turbomolekularną z różnymi usprawnieniami stosowaną do dzisiaj. W latach 70. ubiegłego wieku stosowanie pomp turbomolekularnych rozpowszechniło się również i w spektrometrii mas, co umożliwiło otrzymywanie znacznie niższego ciśnienia, czyli znacznie czystszego środowiska analizy, a co za tym idzie prowadzenie znacznie dokładniejszych analiz.

W połowie lat pięćdziesiątych XX wieku W.C. Wiley, I.H. McLaren, D.B. Harrington, R. Gohlke i F. McLafferty zaczęli stosować spektrometr mas jako detektor dla techniki chromatograficznej, sprzęgając go z chromatografem gazowym. Metoda ta umożliwiła po raz pierwszy oddzielenie i identyfikację mieszanin substancji w roślinach. Okres ten można by przyjąć za początek zestawów analitycznych będących obecnie podstawowym wyposażeniem laboratoriów.

1.2.
Nieco podstaw

Mimo tak wielu i tak różnych zastosowań metody detekcji mas wykorzystywane przez nią zasady teoretyczne oraz konstrukcja aparaturowych zestawów spektrometrów mas będących składowymi różnych technik analitycznych, są podobne (rys. 1.2).

Rys. 1.2. Schematyczne przedstawienie części składowych zestawu analitycznego zawierającego spektrometr mas. AA – aparatura analityczna do przygotowania i nastrzyku próbki, JP – układ jonizacji próbki–źródło jonów, AM – analizator mas, D – detektor, RAD – system rejestracji i analizy danych

1.2.1. Etap pierwszy analizy techniką spektrometrii mas – jonizacja próbki

Próbka przeznaczona do analizy za pomocą zestawu spektrometru mas (rys. 1.2) zostaje najpierw poddana jonizacji, czyli całkowitemu, bądź częściowemu przetworzeniu na jony. Proces jonizacji próbki jest podstawą spektrometrii mas, ponieważ od jego jakości i wydajności zależna jest jakość identyfikacji zarówno jakościowa, jak i ilościowa.

W trakcie jonizacji może nastąpić pękanie wiązań chemicznych, wskutek czego dochodzi do podziału wyjściowej cząsteczki na mniejsze fragmenty. Możliwe jest też wytwarzanie jonów poprzez naładowanie cząstki bez jej fragmentacji. Techniki jonizacyjne to techniki zderzeniowe bądź techniki polowe, interesujący nas analit bombardowany jest różnego rodzaju cząstkami bądź poddawany jest działaniu pola elektrycznego. W okresie ponad już 120 lat historii spektrometrii mas zostało skonstruowane wiele urządzeń jonizujących pracujących zarówno przy obniżonym ciśnieniu, jak i ciśnieniu atmosferycznym oraz umożliwiających jonizacje prostych substancji pierwiastkowych i złożonych substancji białkowych. Techniki te to:

1. Jonizacja elektronami, EI (Electron Ionization, Electron Impact) – jonizacja wysokoenergetycznymi elektronami w fazie gazowej, w warunkach obniżonego ciśnienia. Metoda ta po raz pierwszy została zastosowana przez A.J. Dempstera w 1918 roku. EI charakteryzuje się stosunkowo małą wydajnością jonizacji. Ulega jej poniżej 1% cząsteczek próbki. Oprócz jonu cząsteczkowego (molekularnego) M+ w jej trakcie mogą również powstawać jony fragmentacyjne, charakterystyczne dla struktury cząsteczki. Głównym ograniczeniem tej techniki jest konieczność odparowania próbki, co uniemożliwia analizę związków nietrwałych termicznie. Nie nadaje się ona też do analizy związków polarnych i związków o dużych masach cząsteczkowych.

2. Jonizacja chemiczna, CI (Chemical Ionization). Technika ta była pierwszą techniką niskoenergetyczną umożliwiającą jonizację kolejnych klas związków organicznych, co zdecydowanie rozszerzyło stosowalność spektrometrii mas. Technikę tę zaproponowali Burnaby Muson i Frank H. Field w 1966 roku. Polega ona na bombardowaniu analitu jonami gazów. Jonizacja zachodzi w warunkach obniżonego ciśnienia (około 60 Pa). Stosowanymi gazami są metan, izobutan lub amoniak. W pierwszym etapie jonizowany jest wybrany gaz, a następnie powstałe z niego jony jonizują badany analit. Jony gazu są mniej energetyczne niż elektrony i dlatego jest to łagodna jonizacja niepowodująca fragmentacji cząsteczek.

3. Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym, APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization). Ta forma jonizacji została opracowana przez Evana C. Horninga w 1974 roku i jest zwykle stosowana w połączeniu z chromatografią cieczową. W tej technice jonizacja następuje w komorze nagrzanej do temperatury 350–600oC, nazywanej parownikiem. Odparowany roztwór jest następnie mieszany z gazem rozpylającym/transportowym. Mieszanka ta w strumieniu gazu, najczęściej azotu, przesyłana jest do części, w której znajdują się elektrody, a panująca różnica potencjałów to 3–6 kV. Przy takim potencjale zachodzi wyładowanie koronowe w wyniku czego powstaje plazma azotowa. Jony azotu następnie reagują z cząsteczkami odparowanego rozpuszczalnika, a powstałe w wyniku tego procesu jony jonizują badany analit. Cały więc proces formowania oznaczanych jonów zachodzi w fazie gazowej.

4. Odmianą techniki APCI jest technika jonizacji ciał stałych, czyli technika desorpcyjna, DAPCI (Desorption Atmosheric Pressure Chemical Ionization), zwana również bezpośrednią jonizacją chemiczną, DCI (Direct Chemical Ionization). Technikę tę w 2005 roku zaproponowali Y. Songs i R.G. Cooks, który jest pionierem i osobą szczególnie zasłużoną dla rozwoju jonizacyjnych technik realizowanych pod ciśnieniem atmosferycznym. Jonizacja w tym przypadku odbywa się za pomocą dużej szybkości plazmy gazowo-jonowej. Technika ta jest szczególnie przydatna dla związków o małej polarności. Różnica pomiędzy tymi technikami polega na tym, że w technice APCI gaz zawiera analit, który jest jonizowany w trakcie przejścia mieszanki gazowej przez strefę wyładowań elektrycznych. W technice DAPCI tylko gaz jest ładowany w strefie wyładowań, następnie styka się z analitem i go jonizuje.

5. Elektrorozpylanie, jonizacja w polu elektrycznym, ESI (Electrospray) – jonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym polegająca na rozpylaniu przewodzącej cieczy zawierającej badaną substancję płynącą przez kapilarę, do której przyłożono wysokie napięcie (zwykle 1–5 kV). W takich warunkach przy wylocie kapilary tworzy się mgiełka naładowanych elektrycznie kropli. Teorię tego zjawiska opracował w 1964 roku Geoffrey Taylor. Wraz z rozwojem tej techniki jonizacji została dokonana ważna modyfikacja, mianowicie rurkę z próbką umieszczono w drugiej kapilarze wypełnionej gazem nośnym, który za wylotem wewnętrznej kapilary wspomaga rozpylanie i zapewnia transport naładowanych cząstek do wejścia do analizatora mas (AM na rys. 1.2). Pełne możliwości tej techniki przedstawił pomiędzy 1982 a 1988 rokiem John Benett Fenn, analizując wielkocząsteczkowe biopolimery i wykorzystując fakt, że ESI jest tzw. techniką łagodnej, niskoenergetycznej jonizacji.

Wraz z rozwojem analizy chemicznej, a przede wszystkim ze zwiększeniem zapotrzebowania na analizę coraz to nowych grup związków chemicznych również technika ESI się rozwijała i proponowano jej nowe odmiany. W 1978 roku Calvin Blakly, Mary MacAdams i Marvin L. Vestal opracowali technikę termicznego rozpylania, TE (Thermospray). Badany tą techniką roztwór przed rozpyleniem jest podgrzewany prądem elektrycznym i taka rozgrzana substancja jest następnie rozpylana z prędkością naddźwiękową. Ten rodzaj jonizacji już w 1985 roku został sprzęgnięty z chromatografem cieczowym przez M.L. Vestala i G.J. Fergussona.

Zapotrzebowanie na analizę coraz niższych stężeń (femto- i attomolowych) w coraz mniejszej objętości roztworu, wnikające przede wszystkim z rozwoju analizy proteomicznej, doprowadziło do stworzenia źródła jonów nanorozpylania zwanego NanoESI. Teorię takiej możliwości podał w 1976 roku Iribarne B.A. Thomson, pierwsze zaś zastosowanie analityczne przedstawił Wilm M. Mann w 1994 roku.

Krokiem milowym w rozwoju techniki ESI było wykazanie możliwości jej zastosowania do analizy powierzchni ciał stałych. Ta odmiana techniki rozpylania nazywana jest elektrorozpylaniem desorpcyjnym, DESI (Desorption, Electrospray Ionization). Technikę tę w 2004 roku zaproponowali Z. Takats, J.M. Wiseman, B. Gologan i G. Cooks. DESI różni się od klasycznych technik analizy powierzchni (spektroskopia fotoelektronów, spektroskopia Augera) tym, że wykonywana jest pod ciśnieniem atmosferycznym. W trakcie pomiaru powierzchnia bombardowana jest wysokoenergetycznymi naładowanymi kropelkami, które powodują desorpcję adsorbatu. Technika ta nie wymaga też stosowania matrycy pochłaniającej nadwyżki energii, tak jak podczas jonizacji laserowej, MALDI.

6. Technika jonizacji w czasie rzeczywistym, DART (Direct Analysis in the Real Time) została wprowadzona do badań analitycznych w 2005 roku przez R.B. Cody’ego, J.A. Larama i H.D. Dursta. Jest to sposób jonizacji w atmosferze powietrza i pod ciśnieniem normalnym. Próbka jest jonizowana naładowanym gorącym gazem (hel, lub azot), przez co jej zasada działania jest podobna do techniki DESI.

7. Bombardowanie szybkimi atomami, FAB (Fast-Atom Bombardment). Metodę tę w 1981 roku opracowali M. Barber, R.S. Bordoli, R.D. Sedgewick i A.N. Tyler. Jest to technika niskociśnieniowa polegająca na bombardowaniu analitu obojętnymi atomami o wysokiej energii, zwykle 17 eV lub 70 eV. Badany analit może znajdować się w fazie gazowej lub być rozpuszczony w ciekłej i mało lotnej matrycy, na przykład w glicerolu. Jest to technika o stosunkowo niskim stopniu fragmentacji wytwarzająca głównie cząsteczki protonowane lub deprotonowane. Technika ta jest więc atrakcyjna do oznaczania sekwencji aminokwasowych. Rolą matrycy (rozpuszczalnika) w metodzie FAB jest: 1) absorpcja energii rozpędzonych atomów uderzających w powierzchnię roztworu, 2) rozpuszczenie analitu, 3) ciągłe odnawianie powierzchni roztworu, 4) wspomaganie jonizacji jako donor/akceptor protonów bądź elektronów.

8. Bombardowanie jonami, spektrometria mas jonów wtórnych, SIMS (Secondary Ion Mass Spectrometry). Skonstruowanie tego źródła jonizacji umożliwił rozwój techniki pomp próżniowych w drugiej połowie lat czterdziestych ubiegłego wieku. W tej technice badana powierzchnia bombardowana jest jonami, a analizie podlegają jony wybite z powierzchni. Pierwsze, prototypowe eksperymenty techniką SIMS zostały przeprowadzone w 1949 roku przez R.F.K. Herzoga i F. Viehboecka w Austrii, a w 1958 roku R.E. Honig skonstruował instrument SIMS w USA. Jony stosowane w tej technice to jony gazów szlachetnych, ⁴⁰Ar+ i Xe+, jony tlenu, ¹⁶O–, ¹⁶O₂+, ¹⁶O₂– oraz SF₅+, C₆₀+ (fuleren) oraz ¹³³Cs+. Najnowszym rozwiązaniem dla techniki SIMS są źródła wykorzystujące jony metali ciekłych, mianowicie Ga, Au, In i Bi. Te źródła są wyjątkowo atrakcyjne ze względu na możliwość zogniskowania wiązki poniżej 50 nm.

Technika bombardowania jonami okazała się tak atrakcyjna, że NASA zaczęło sponsorować jej rozwój i w latach sześćdziesiątych XX wieku zastosowano ją do analizy skał księżycowych.

9. Jonizacja w plazmie sprzężonej indukcyjnie, ICP (Inductively Coupled Plasma). Jest to jonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym. Pojęcie plazmy wprowadził amerykański fizykochemik Irving Langmuir już w 1928 roku. Badany roztwór jest rozpylany i jego krople są wprowadzane do palnika plazmowego. W palniku znajduje się wytworzona plazma argonowa. Część palnika otoczona jest cewką indukcyjną, przez którą przepływa prąd zmienny o wysokiej częstotliwości. Plazma ogrzewa się do temperatury nawet rzędu 10 000 K w wyniku wzbudzenia polem magnetycznym wytworzonym przez prąd płynący w cewce. Energia plazmy jest wystarczająca do jonizacji wprowadzonej do niej próbki, co wykazali R.D. MacFarlane i D.F. Torgerson w 1974 roku. Metoda ta nadaje się więc doskonale do analizy pierwiastków. Technika ta została zaproponowana w 1978 roku przez Allana L. Graya, a już w 1980 roku Robert S. Houk i Allan L. Gray zaprezentowali pierwszy aparat ICP-MS.