Spektroskopia oscylacyjna - ebook

4.1. Spektroskopia rezonansowego rozpraszania ramanowskiego Katarzyna M. Marzec, Jakub Dybaś

4.1.1. Rezonansowy a normalny efekt ramanowski oraz fluorescencja

Podobnie jak normalny efekt ramanowski (patrz rozdział 2), także rezonansowy efekt rozpraszania ramanowskiego (RRS, ang. resonance Raman scaterring) może być opisany jako proces dwufotonowy. Różnice pomiędzy obydwoma uwidoczniają się w energii promieniowania wzbudzającego. W przypadku NR dostarczona energia pozwala na przejście fotonu do stanu wirtualnego, który położony jest znacznie poniżej pierwszego stanu elektronowego, podczas gdy w RRS energia wzbudzająca prowadzi do przejścia fotonu do stanu wirtualnego wzbudzonego stanu elektronowego danej grupy chromoforowej (rys. 4.1.1). W drugiej części procesu – identycznie jak w NR – dochodzi do emisji fotonu o tej samej (rozpraszanie rayleighowskie), niższej (rozpraszanie stokesowskie) lub wyższej (rozpraszanie antystokesowskie) energii. Obecność dodatkowego przejścia elektronowego w przypadku RRS skutkuje silnym wzmocnieniem (o rząd 10³–10⁶) konkretnych pasm w widmie ramanowskim, pochodzących od drgań w grupie chromoforowej .

Rys. 4.1.1. Diagram energetyczny porównujący procesy normalnego i rezonansowego rozpraszania ramanowskiego oraz fluorescencji

Możliwe jest także zaobserwowanie zjawiska pre-rezonansu, które może wystąpić, gdy linia wzbudzająca położona jest wystarczająco blisko wzbudzonego stanu elektronowego, a które również skutkuje wzmocnieniem pasm na widmie.

Różnice pomiędzy rezonansowym efektem ramanowskim a fluorescencją zachodzą na poziomie wzbudzonego stanu elektronowego. Czas życia stanu wzbudzonego w przypadku RRS wynosi około 10⁻¹⁴ s, natomiast dla fluorescencji oscyluje on w granicach 10⁻⁸–10⁻⁵ s. Ponadto widmo fluorescencji jest obserwowane, gdy wzbudzenie cząsteczki ulega wygaszeniu poprzez bezpromieniste przejście z dyskretnego poziomu na najniższy oscylacyjny poziom wzbudzonego stanu elektronowego, co nie jest obserwowane w RRS. Proces kończy się w chwili promienistej emisji energii. Słabe sygnały ramanowskie mogą być przykrywane przez silne sygnały fluorescencyjne, zawdzięczające swoją charakterystykę długim czasom życia stanów wzbudzonych. Sytuacja taka jest obserwowana nie tylko dla fluoryzujących molekuł wzbudzonych daną linią lasera (w zakresie światła widzialnego), ale także dla wielu próbek złożonych, w których fluoryzować może któryś ze składników matrycy . Za przykład może posłużyć autofluorescencja elastycznych włókien laminy wzbudzonych linią lasera 532 nm – nawet jeśli żaden z głównych składników (elastyna i kolagen) tej występującej w aorcie struktury nie jest molekułą fluoryzującą przy podanej długości fali .

Istnieje kilka zabiegów, które można zastosować w celu wyeliminowania przeszkadzającej na widmie ramanowskim fluorescencji. Jednym z nich jest wykorzystanie innej linii lasera jako źródła wzbudzenia. Dobrym pomysłem może okazać się także próba naświetlania próbki stosowanym laserem przez pewien czas przed dokonaniem pomiaru ramanowskiego, co doprowadzi do fotoindukowanej destrukcji chromoforu. Zjawisko to, nazywane „fotoblaknięciem” (ang. photobleaching), jest wykorzystywane do otrzymywania widm ramanowskich białek oraz próbek biologicznych. Fluorescencja może być także zredukowana za pomocą ramanowskich układów konfokalnych. W takich aparaturach próbka jest penetrowana wyłącznie w konkretnej płaszczyźnie (sygnał nie jest zbierany z całej objętości próbki), co ogranicza fluorescencję pochodzącą od potencjalnych zanieczyszczeń. Ponadto w takich warunkach próbka jest wystarczająco wzbudzona, by osiągnąć wysycenie fluorofora. W konsekwencji wzrost długości fali wzbudzenia powoduje wzrost sygnału ramanowskiego, a spadek emisji fluorescencji.

4.1.2. Zjawisko rezonansowego efektu ramanowskiego

W rozdziale 2 opisano, że moment przejścia dla NR musi przyjmować wartości różne od zera (równanie 2.3), co jest wymuszone zmianą polaryzowalności podczas przejścia pomiędzy stanami wibracyjnymi – z początkowego stanu m do końcowego n (patrz rys. 4.1.1). Założono także, że intensywność stokesowskiego pasma ramanowskiego dana jest równaniem 2.4, gdzie ν_(mn) = ν_(osc).

(4.1)

W przypadku RRS, α_(mn) reprezentować będzie zmianę polaryzowalności α podczas przejścia pomiędzy stanami m→e→n, gdzie e oznacza wzbudzony stan elektronowy (rys. 4.1.1). To dlatego tensor polaryzowalności α_(mn) w RRS zależy zarówno od częstości (ν_(me) i ν_(en)), jak i od momentów przejść elektronowych (M_(me) i M_(en)), odpowiadających różnicy energii pomiędzy stanami m→e→n.

W NR próbka jest naświetlana linią wzbudzającą, której energia jest znacznie mniejsza niż ta, która jest wymagana do przejścia elektronowego, tak więc ν₀<< ν_(me). Zupełnie inaczej jest w RRS, gdzie ν₀ sięga wartości ν_(me), co wpływa na zwiększenie α_(mn) i w konsekwencji zwiększenie intensywności (I_(mn)) pasma ramanowskiego przy ν₀ – ν_(mn) o kilka rzędów w porównaniu z NR.

Dzięki temu, w przeciwieństwie do nierezonansowej NR, nawet składniki o bardzo niskich stężeniach mogą być wykrywane i analizowane przy użyciu odpowiednio dobranej długości fali wzbudzającej. Dowodzi to wysokiej czułości techniki RRS, którą można wykorzystać do badań niektórych próbek nawet w stężeniach rzędu 10⁻⁸ M .

Aby w pełni wykorzystać możliwości RRS, dobrze jest znać widmo absorpcyjne UV-Vis danej próbki. W celu uzyskania widma rezonansowego RS próbka musi bowiem zostać naświetlona linią wzbudzającą o długości fali pokrywającej się z przejściem elektronowym danego chromoforu. Zatem profil UV-Vis pozwoli dobrać odpowiednią długość fali promieniowania wzbudzającego.

Rys. 4.1.2. Model widma absorpcyjnego UV-Vis cząsteczki X zawierającej dwie grupy chromoforowe, których maksima absorpcyjne położone są przy λA i λB. Wzbudzenie cząsteczki linią lasera o długości fali, odpowiednio λA i λB, będzie skutkować otrzymaniem dwóch różnych rezonansowo wzmocnionych widm ramanowskich chromoforów A i B. Wszystkie ugrupowania cząsteczki zostaną z kolei nierezonansowo wzbudzone w przypadku wykorzystania lasera o długości fali odpowiadającej λC

Wyobraźmy sobie cząsteczkę X zawierającą dwa ugrupowania chromoforowe, A i B, których maksima absorpcji znajdują się odpowiednio przy długościach fal λ_(A) i λ_(B). Teoretyczny model widma UV-Vis takiej molekuły został przedstawiony na rysunku 4.1.2. Aby selektywnie wzmocnić oscylacje chromoforu A, długość fali wzbudzającej musi mieć ν₀ blisko ν_(A) (co dokładnie odpowiada λ_(A)). Z kolei oscylacje chromoforu B będą wzmocnione, gdy długość fali lasera będzie równa λ_(B). Z drugiej strony, jeżeli do wzbudzenia użyjemy długości fali λ_(C), to zaobserwujemy nierezonansowe widmo RS pochodzące od wszystkich fragmentów całej cząsteczki. Właśnie dlatego elektronowe widmo absorpcyjne UV-Vis badanego związku pozwoli na dobranie najbardziej odpowiedniej długości fali do obserwacji oscylacji konkretnej grupy chromoforowej. Zmieniając długość fali wzbudzającej, możemy otrzymywać różne widma RRS tej samej molekuły, uzyskując w ten sposób informacje o różnych jej fragmentach. Takie selektywne wzmacnianie dowodzi wysokiej specyficzności techniki RRS.

Szczegółowa interpretacja widma UV-Vis może zapewnić dodatkową informację o rodzaju zjawiska RRS. Albrecht i współpracownicy zaproponowali kilka mechanizmów, na drodze których dochodzi do wzrostu intensywności pasm w widmach RRS. Jest to głównie rozpraszanie typu A (Francka-Condona) oraz B (sprzężenia wibronowe Herzberga-Tellera) . W rozpraszaniu A/Francka-Condona tylko całkowicie symetryczne drgania są wzmocnione na widmie RRS. Ten typ rozpraszania jest charakterystyczny dla wielu związków chemicznych. Na przykład widoczny jest w widmach RRS dla TiI₄ i NH₃ otrzymanych z użyciem odpowiednio linii lasera 514,5 nm oraz 216,8 nm . Niezgodna z regułą Condona zależność elektronowego momentu przejścia od współrzędnej wibracyjnej jest możliwa we wzmocnieniu typu B, gdzie zarówno symetryczne, jak i niesymetryczne drgania mogą ulec wzmocnieniu. Jednakże wielkość wzmocnienia dla drgań symetrycznych jest tu niższa niż we wzmocnieniu opartym na regule A. Rozpraszanie oparte na regule B jest dominujące tylko dla drgań niesymetrycznych . Rezonansowe rozpraszanie tego typu wywołuje sprzężenie wibronowe pomiędzy dwoma dozwolonymi przejściami elektronowymi. Sztandarowym przykładem takiego wzmocnienia są widma RRS dla metaloporfiryn wzbudzonych linią lasera z zakresu pasm Q widm UV-Vis (ok. 500–600 nm). Jeżeli wzmocnienie drgań nie może wystąpić na podstawie reguły A lub B, a przejście jest zabronione zgodnie z geometrią i równowagą cząsteczki, to może wystąpić wzmocnienie typu C, co skutkować będzie pojawieniem się nadtonów i pasm kombinacyjnych .

4.1.3. Zastosowanie i możliwości RRS

Technika RRS odznacza się wyższą czułością i selektywnością w porównaniu z NR, co daje jej przewagę w wielu zastosowaniach analitycznych. Podobnie jak NR, tak i RRS umożliwia badanie próbek w stanie gazowym, ciekłym i stałym. Z dużą skutecznością stosuje się ją w historii sztuki, archeologii czy kryminalistyce – do badania składu różnych pigmentów i barwników. Jest nieinwazyjną i nieszkodliwą metodą, wykorzystywaną do określania dystrybucji i koncentracji różnych biocząsteczek wewnątrz tkanek roślinnych i zwierzęcych. Została na przykład zastosowana do badania zawartości karotenoidów w ludzkiej skórze, jako biomarker ilości spożycia warzyw i owoców . Pojedynczy pomiar RRS ludzkiej skóry pozwolił na dopasowanie indywidualnego dla niej profilu karotenoidów oraz na znalezienie czynników wspólnych dla całej populacji . Zastosowanie różnych długości fal wzbudzających pozwoliło również zbadać mieszaniny retinoidów i odróżnienie od siebie luteiny, wiolaksantyny, 9-cis-neoksantyny oraz β-karotenu . Zastosowanie linii wzbudzającej o długości fali 532 nm pozwala na obserwację pre-rezonansowego widma ramanowskiego retinoli, co zostało wykorzystane do zbadania dystrybucji witaminy A w tkankach pochodzących z wątroby i płuc .

Rezonansowa spektroskopia ramanowska jest od dawna wykorzystywana w badaniach dynamiki molekularnej różnych metaloprotein, wśród których najpopularniejszym obiektem jest hemoglobina . Ta biomolekuła zawiera hem, wysoce symetryczną i bogatą w chromofory grupę prostetyczną, która zapewnia silne wzmocnienie drgań, zwłaszcza gdy do wzbudzenia zostanie użyty laser o długości fali odpowiadającej przejściom elektronowym. Na widmie UV-Vis hemoglobiny obserwujemy maksima położone przy ~400 nm (pasmo Soreta), 525 nm (pasmo Q_(v) lub α) oraz 575 nm (pasmo Q₀ lub β) . Ponadto techniką RRS mogą być badane także łańcuchy polipeptydowe białek hemowych, które wykazują przejścia elektronowe poniżej 250 nm. Z powodzeniem zastosowano ją nie tylko do standardów hemoporfiryn, ale także do analizy i wizualizacji 2- i 3D dystrybucji hemoglobiny, zarówno w komórkach, jak i w tkankach . Metoda ta zapewnia także otrzymanie widma z pojedynczych erytrocytów o znakomitym stosunku sygnału do szumu i wysokiej powtarzalności, co wykorzystano do badań różnych rodzajów patologii hemoglobiny .

Podobnie jak białka hemowe, także łańcuchy polipeptydowe innych białek, lub nawet interakcje białko–lek, mogą być badane z wykorzystaniem źródeł wzbudzających o długości fali poniżej 260 nm. Zastosowanie RRS w tak dalekim UV zaowocowało możliwością badania DNA, RNA i kwasów nukleinowych . Choć laserem o tak niskich liniach są badane głównie biocząsteczki, okazuje się, że można również zastosować te długości fal do badań katalizatorów i heterogenicznych reakcji katalitycznych . Jak wspomniano wcześniej, dzięki rezonansowym efektom ta technika oscylacyjna zapewnia także informację o elektronowej strukturze badanej próbki. Czyni to z RRS metodę bardzo przydatną w nanotechnologii czy inżynierii materiałowej – do badań i charakterystyki strukturalnej takich materiałów, jak nanorurki węglowe, grafit, grafen i wiele innych .

4.1.4. Aparatura

Do detekcji rezonansowych sygnałów ramanowskich można wykorzystywać standardową aparaturę do RS (jak przedstawiono to już i opisano w rozdziale 2). Selektywne wzmocnienie danych chromoforów w cząsteczce może być uzyskane poprzez zmianę długości fali wzbudzającej. To dlatego lasery przestrajalne, w których można zmieniać długość fali w pewnym zakresie, są w tej technice stosowane powszechnie.

Aby uzyskać jeszcze wyższą czułość i selektywność, RRS jest z powodzeniem stosowany w kombinacji z chromatografią cieczową czy techniką SERS (patrz rozdział 4.3). Odmianą tej ostatniej jest spektroskopia ramanowska wzmocniona tipem (ang. tip-enhanced Raman spectroscopy, TERS), w której także można dodatkowo wykorzystywać zjawisko występowania rezonansu (ang. tip-enhanced resonance Raman spectroscopy, TERRS), co rokuje szczególnie obiecująco dla przyszłych zastosowań nanoanalitycznych .

Bibliografia

1. Ferraro J.R., Nakamoto K., Introductory Raman Spectroscopy, Academic Press Inc., San Diego 1994.

2. Matousek P., Towrie M., Parker A.W., Fluorescence background suppression in Raman spectroscopy using combined Kerr gated and shifted excitation Raman difference techniques, J. Raman Spectrosc. 2002, 33, 238.

3. Marzec K.M., Wrobel T.P., Rygula A., Maslak E., Jasztal A., Fedorowicz A., Chlopicki S., Baranska M., Visualization of the biochemical markers of atherosclerotic plaque with the use of Raman, IR and AFM, J. Biophotonics 2014, 7, 744.

4. Krishnan R.S., Shankar R.K., Raman effect: History of the discovery, J. Raman Spectrosc. 1981, 10, 1.

5. Albrecht A.C., On the theory of Raman intensities, J. Chem. Phys. 1961, 34, 1476.

6. Albrecht A.C., Hutley M.C., On the Dependence of Vibrational Raman. Intensity on the Wavelength of Incident Light, J. Chem. Phys. 1971, 55, 4438.

7. Tang J., Albrecht A.C., Raman Spectroscopy: Theory and Practice (ed. H.A. Szymanski) Plenum, New York 1970, 2, s. 33–68.

8. Asher S.A., UV resonance Raman studies of molecular structure and dynamics: applications in physical and biophysical chemistry, Anun. Rev. Phys. Chem. 1988, 39, 537.

9. Wang J., Takahashi S., Rousseau D.L., Identification of the overtone of the Fe–CO stretching mode in heme proteins: a probe of the heme active site, Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, 92, 9402.

10. Marzec K.M., Perez-Guaita D., De Veij M., McNaughton D., Baranska M., Dixon M.W.A., Tilley L., Wood B.R., Red Blood Cells Polarize Green Laser Light Revealing Hemoglobin’s Enhanced Non-Fundamental Raman Modes, Chem. Phys. Chem. 2014, 15, 3963.

11. Scarmo S., Cartmel B., Lin H., Leffell D.J., Ermakov I.V., Gellermann W., Bernstein P.S., Mayne S.T., Single v. multiple measures of skin carotenoids by resonance Raman spectroscopy as a biomarker of usual carotenoid status, Br. J. Nutr. 2013, 110, 911.

12. Scarmo S., Henebery K., Peracchio H., Cartmel B., Lin H., Ermakov I.V., Gellermann W., Bernstein P.S., Duffy V.B., Mayne S.T., Skin carotenoid status measured by resonance Raman spectroscopy as a biomarker of fruit and vegetable intake in preschool children, Eur. J. Clin. Nutr. 2013, 66, 555.

13. Andreeva A., Velitchkova M., Resonance Raman spectroscopy of carotenoids in Photosystem I particles, Biophys. Chem. 2005, 114, 129.

14. Kochan K., Marzec K.M., Chruszcz-Lipska K., Jasztal A., Maslak E., Musiolik H., Chlopicki S., Baranska M., Pathological changes in the biochemical profile of the liver in atherosclerosis and diabetes assessed by Raman spectroscopy, Analyst 2013, 138, 3885.

15. Marzec K.M., Kochan K., Fedorowicz A., Jasztal A., Chruszcz-Lipska K., Dobrowolski J.Cz., Chlopicki S., Baranska M., Raman microimaging of murine lungs: insight into the vitamin A content, Analyst 2015, 140, 2171.

16. Spiro T.G., Biological Applications of Raman Spectroscopy: Resonance Raman Spectra of Heme and Metalloproteins, vol. 3, John Wiley & Sons, New York 1988.

17. Yamamoto T., Palmer G., The valence and spin state of iron in oxyhemoglobin as inferred from resonance Raman spectroscopy, J. Biol. Chem. 1973, 248, 5211.

18. Marzec K.M., Rygula A., Wood B.R., Chlopicki S., Baranska M., High-resolution Raman imaging reveals spatial location of heme oxidation sites in single red blood cells of dried smears, J. Raman Spectrosc. 2015, 46, 76.

19. Wood B.R., Caspers P., Puppels G.J., Pandiancherri S., McNaughton D., Resonance Raman spectroscopy of red blood cells using near-infrared laser excitation, Anal. Bioanal. Chem. 2007, 387, 1691.

20. Wood B.R., McNaughton D., Vibrational Spectroscopy for Medical Diagnosis, eds. M. Diem, P.R. Griffiths, J.M. Chalmers, John Wiley & Sons, UK 2008, s. 261–309.

21. Blazej D.C., Peticolas W.L., Ultraviolet resonant Raman Spectroscopy of nucleicacid components, Proc. Nati. Acad. Sci. 1977, 74, 2639.

22. Wojtuszewski K., Mukerji I., The HU-DNA binding interaction probed with UV resonance Raman spectroscopy: Structural elements of specificity, Protein Sci. 2004, 13, 2416.

23. Kim H., Kosuda K.M., Van Duyne K.P., Stair P.C., Resonance Raman and surface-and-tip-enhanced Raman spectroscopy methods to study solid catalysts and heterogeneous catalytic reactions, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 4820.

24. Jorio A., Pimenta M.A., Souza Filho A.G., Saito R., Dresselhaus G., Dresselhaus M.S., Characterizing carbon nanotube samples with resonance Raman scattering, New J. Phys. 2003, 5, 139.1.

25. Zolyomi V., Koltai J., Kurti J., Resonance Raman spectroscopy of graphite and graphene, Phys. Status Solidi 2011, B248, 11, 2435.

26. Dijkstra R.J., Ariese F., Gooijer C., Brinkman U.A.Th., Raman spectroscopy as a detection method for liquid-separation techniques, TrAC Trends in Analytical Chemistry 2005, 24, 304.

27. Taguchi A., Hayazawa N., Furusawa K., Ishitobi H., Kawata S., Deep-UV tip-enhanced Raman scattering, J. Raman Spectrosc. 2009, 40, 1324.4.2. Powierzchniowo wzmocnione rozpraszanie ramanowskie (SERS) Agata Królikowska, Jolanta Bukowska

Nieelastyczne rozproszenie światła nazywane „rozpraszaniem ramanowskim” jest zjawiskiem słabym – ulega mu jedynie ok. 1 na 10⁷ fotonów padającego promieniowania. Pozostała część promieniowania rozpraszana jest w sposób elastyczny (tzw. rozpraszanie Rayleigha).

Wraz z rozwojem aparatury pomiarowej (źródła światła, wysokoczułe detektory) nastąpił znaczny postęp w jakości rejestrowanych widm ramanowskich. Jednak w wielu eksperymentach, zwłaszcza gdy chcemy obserwować widmo niewielkiej liczby cząsteczek, konieczne jest wzmocnienie rozproszonego promieniowania. W spektroskopii ramanowskiej stosuje się trzy zasadnicze sposoby wzmacniania widma:

1. Zastosowanie promieniowania wzbudzającego o energii odpowiadającej energii dozwolonego przejścia elektronowego cząsteczki (rezonansowy efekt Ramana; patrz rozdział 4.1).

2. Wykorzystanie tzw. nieliniowych efektów ramanowskich.

3. Wykorzystanie oddziaływania cząsteczek z powierzchnią nanocząstek metali.

Ten trzeci sposób jest podstawą spektroskopii powierzchniowo wzmocnionego rozproszenia Ramana, w skrócie SERS (ang. surface-enhanced Raman scattering).

Zjawisko SERS zaobserwowali po raz pierwszy Fleischmann i współpracownicy w 1974 roku , rejestrując widmo pirydyny zaadsorbowanej na elektrodzie srebrowej. Odkrycie to nie zostało jednak przez nich w pełni zrozumiane. Dopiero prace zespołów Van Duyna i Creightona z 1977 roku pokazały, że zarejestrowanie widma molekuł zaadsorbowanych na powierzchni metalu możliwe jest dzięki gigantycznemu wzmocnieniu rozproszenia ramanowskiego. Wykazano, że źródłem tego wzmocnienia, szacowanego na rząd 10⁴–10⁶, jest chropowata powierzchnia elektrody Ag. Wiele intensywnych badań, zarówno eksperymentalnych, jak i teoretycznych, prowadzonych w następnych kilkudziesięciu latach, doprowadziło do zrozumienia podstaw fizycznych efektu SERS i poznania mechanizmu wzmocnienia sygnału ramanowskiego przez niektóre rodzaje powierzchni metali.

4.2.1. Mechanizm wzmocnienia powierzchniowego

Zasadniczym źródłem wzmocnienia rozproszenia ramanowskiego cząsteczek chemicznych znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie nanocząstek metali jest gigantyczne pole elektromagnetyczne, generowane przez metaliczne nanocząstki. Zjawiskiem odpowiedzialnym za wytworzenie tak silnych pól jest tzw. rezonans plazmonowy. Rezonans plazmonowy występuje wówczas, gdy częstość promieniowania elektromagnetycznego padającego na nanoczastkę metalu jest bardzo zbliżona do częstości drgań gazu elektronowego metalu. Dla gładkich powierzchni metalu częstości drgań elektronów są odległe od typowych częstości wiązek światła stosowanego w spektroskopii ramanowskiej (gdzie używa się zakresu światła widzialnego czy bliskiej podczerwieni). Jeżeli jednak powierzchnia jest chropowata i występują na niej skupiska atomów o rozmiarach rzędu 10–10² nm, to światło to może wzbudzić tzw. zlokalizowane powierzchniowe plazmony (ang. LSP, localized surface plasmons), czyli kolektywne oscylacje elektronów przewodnictwa, zlokalizowane w nanostrukturach. Gdy częstość promieniowania laserowego stosowanego do wzbudzania widma Ramana (pole o natężeniu E₀) jest zbliżona do częstości LSP, wystąpi zjawisko rezonansu plazmonowego, któremu towarzyszy wygenerowanie przez nanocząstkę bardzo silnego pola elektromagnetycznego E_(s) (rys. 4.2.1). Natężenie tego pola zależy od kształtu i rozmiarów nanostruktury, typu metalu i przenikalności elektrycznej ośrodka otaczającego. Rozpraszanie ramanowskie przez molekułę zaadsorbowaną na powierzchni nanostruktury jest zatem wzbudzane przez wzmocnione pole o natężeniu E_(s), będąc z kolei źródłem pola E_(R) o częstości promieniowania ramanowskiego. Pole E_(R) może być następnie wzmacniane przez nanocząstkę w podobny sposób jak na pierwszym etapie, czyli wskutek rezonansu plazmonowego.

Rys. 4.2.1. Mechanizm wzmocnienia elektromagnetycznego (objaśnienia symboli w tekście)

W rezultacie, pamiętając, że intensywność światła rozproszonego ramanowsko jest proporcjonalna do E², widzimy, że intensywność pasma w widmie SERS jest określona przez iloczyn E_(s)² × E_(R)²:

I_(SERS) ~ E_(s)² × E_(R)².

(4.2.1)

Warunek rezonansu plazmonowego nie jest, oczywiście, spełniony w jednakowym stopniu dla obu częstości (częstości światła padającego i częstości rozproszonego ramanowsko promieniowania). Możemy jednak z dość dobrym przybliżeniem przyjąć, że dla niskich częstości drgań, dla których częstość rozproszonego promieniowania niewiele różni się od częstości światła wzbudzającego, E_(R) jest zbliżone do E_(s). Można wówczas przyjąć zależność:

I_(SERS) ~ E_(s)⁴.

(4.2.2)

To wyrażenie tłumaczy gigantyczny przyrost intensywności rozproszenia ramanowskiego molekuł zaadsorbowanych na nanocząstkach metali.

Opisany wyżej mechanizm elektromagnetyczny stanowi najistotniejszy wkład w zjawisko wzmocnienia powierzchniowego. Jednak szereg obserwacji doświadczalnych, m.in. fakt, że silniejsze wzmocnienie uzyskujemy dla cząsteczek chemisorbowanych na powierzchni niż dla cząsteczek słabo zaadsorbowanych fizycznie, spowodował poszukiwanie innych jeszcze źródeł wzmocnienia widma SERS. Uznaje się, że – oprócz wkładu elektromagnetycznego – za całkowite wzmocnienie widma odpowiedzialny jest także efekt nazwany „chemicznym” albo charge transfer (CT), przeniesienia ładunku między metalem a zaadsorbowaną cząsteczką.

Rys. 4.2.2. Wzmocnienie efektem chemicznym (CT) dla przeniesienia ładunku z metalu na molekułę. EF – energia poziomu Fermiego metalu. Wzmocnienie nastąpi, gdy energia wiązki wzbudzającej (hν₀) zostanie dopasowana do różnicy energii nieobsadzonego poziomu LUMO (E_(CT)) i EF. hνR – energia fotonu ramanowskiego

Zjawisko CT rozpatrujemy jako proces dwuetapowy (rys. 4.2.2). W pierwszym etapie foton wiązki laserowej o energii hν₀ powoduje przeniesienie elektronu z poziomu Fermiego metalu na nieobsadzony poziom LUMO (ang. lowest unoccupied molecular orbital) molekuły zaadsorbowanej na nanocząstce metalu. W drugim etapie elektron powraca do metalu, czemu towarzyszy wypromieniowanie fotonu o mniejszej energii (fotonu stokesowskiego), z jednoczesnym wzbudzeniem oscylacji molekuły. Możliwe jest także przeniesienie ładunku z najwyżej obsadzonego poziomu molekuły (HOMO, ang. highest occupied molecular orbital) do metalu. W każdym z tych przypadków musi wystąpić dopasowanie energii fotonu padającego do różnicy energii między poziomem Fermiego a poziomem LUMO lub HOMO. Mamy zatem wówczas do czynienia ze zjawiskiem podobnym do rezonansowego efektu Ramana, ale z udziałem poziomów metalu (kompleks CT). Wzmocnienie członem CT jest jednak w większości przypadków niezbyt duże, rzędu 10–10². Całkowity współczynnik wzmocnienia w widmie SERS jest iloczynem wkładów: elektromagnetycznego (E_(EM)) i chemicznego (E_(CT)):

E_(F) = E_(EM) × E_(CT).

(4.2.3)

Widmo SERS można wzmocnić dodatkowo, stosując wzbudzenie w obszarze absorpcji elektronowej badanej cząsteczki. W tych warunkach, jak wiadomo, bez obecności nanocząstek powstaje rezonansowe widmo Ramana (RR), kilka rzędów silniejsze od zwykłego widma ramanowskiego. Jeżeli dodatkowo zaadsorbujemy cząsteczkę na nanostrukturalnym podłożu przygotowanym w taki sposób, aby uzyskać dobre wzmocnienie powierzchniowe dla stosowanej długości fali wiązki laserowej, to te dwa rodzaje wzmocnienia: molekularny (widmo rezonansowe) i powierzchniowy (SERS), nałożą się i uzyskamy znacznie silniejsze widmo niż w „zwykłym” efekcie SERS. Takie zjawisko nazywamy „powierzchniowo wzmocnionym rezonansowym rozpraszaniem ramanowskim” (SERRS).

4.2.2. Rodzaje podłoży stosowanych w spektroskopii SERS

W spektroskopii SERS kluczowe jest przygotowanie dobrego podłoża metalicznego, zapewniającego wysokie wartości współczynników wzmocnienia powierzchniowego. Wprawdzie wiele metali wykazuje wzmocnienie, jednak najlepszymi są srebro, złoto i miedź. Łatwość utleniania się powierzchni Cu powoduje, że w praktyce najczęściej wykorzystuje się srebro i złoto. Właściwości optyczne tych metali powodują, że zakres pracy Ag jest znacznie szerszy niż Au. O ile bowiem dla srebra występuje wysokie wzmocnienie w szerokim zakresie energii promieniowania laserowego zwykle stosowanego w spektroskopii ramanowskiej (światło widzialne i bliska podczerwień), o tyle dla złota wzmocnienie uzyskuje się wyłącznie dla promieniowania niżej energetycznego (światło czerwone i bliska podczerwień). Aby uzyskać dobre wzmocnienie widma poprzez rezonans plazmonowy, należy wytworzyć nanocząstki metalu o odpowiednim rozmiarze i kształcie. Lista nanostruktur, które są efektywnymi nanorezonatorami i zapewniają duże wzmocnienie, jest bardzo długa. Najważniejsze rodzaje podłoży do spektroskopii SERS to:

1. Elektrochemicznie chropowacone elektrody.

2. Koloidalne zawiesiny metali, wytwarzane np. na drodze chemicznej redukcji lub metodą ablacji laserowej; tak uzyskane nanocząstki mogą być osadzane także na stałych, nieaktywnych w SERS podłożach (szkło, Si, gładkie złoto).

3. Cienkie filmy Ag lub Au, nanoszone na polistyrenowe lub krzemionkowe nanosfery o kontrolowanym rozmiarze, osadzone na stałym podłożu (FON, ang. film over nanospheres).

4. Periodycznie uporządkowane nanostruktury wytwarzane na stałych podłożach, np. metodami litografii w wiązkach elektronowych.

Ze względu na łatwość otrzymywania, a zarazem bardzo efektywne wzmacnianie widma ramanowskiego, najbardziej popularne stały się dwie pierwsze metody. Warto pamiętać, że właściwości plazmonowe nanocząstek, a zatem ich współczynniki wzmocnienia elektromagnetycznego, mogą być skutecznie poprawiane przez kontrolę ich rozmiaru i kształtu. Stwierdzono, że najbardziej intensywne pola elektromagnetyczne, decydujące o wzmocnieniu, generowane są na przykład na ostrych krawędziach, narożach wielościanów, w wąskich (ok. 2 nm) przestrzeniach między zagregowanymi nanostrukturami. Stąd efektywnymi nanorezonatorami okazują się nanocząstki w formie trójkątów, sześcianów, gwiazdek, nanostruktury przypominające kwiaty itd. Ważnym elementem jest także właściwa agregacja nanocząstek, zapewniająca wytworzenie pomiędzy nimi przestrzeni, w których występują silne pola elektromagnetyczne. Zwykle dokonuje się tego przez zaadsorbowanie na powierzchni nanocząstki odpowiednich związków chemicznych. W niektórych eksperymentach istotne jest uzyskanie rezonansu plazmonowego przy określonych częstościach. Tak jest na przykład w układach biologicznych wykazujących silną fluorescencję. Aby ominąć ten problem, należy widmo SERS wzbudzać w obszarze bliskiej podczerwieni. Możliwe jest to dzięki sferycznym nanocząstkom o strukturze rdzeń (SiO₂)–skorupka (Au lub Ag) (ang. core-shell), o kontrolowanym stosunku grubości skorupki do średnicy rdzenia. Podobnie działają nanoskorupki Au/Ag puste w środku.

4.2.3. Cechy widm SERS

Ze względu na mechanizm wzmocnienia powierzchniowego, a także na fakt, że obserwujemy widma molekuł oddziałujących z metalem, zarówno położenia pasm, jak i ich względne intensywności w widmach SERS nie pokrywają się z parametrami pasm w zwykłym widmie Ramana danego związku chemicznego. Charakterystyczne dla widm SERS jest poszerzenie pasm. Widmo SERS jest na ogół uboższe, ponieważ zarówno człon elektromagnetyczny wzmocnienia powierzchniowego, jak i człon CT mogą selektywnie wzmacniać tylko niektóre przejścia oscylacyjne.

Pole elektryczne na powierzchni metalu jest silnie anizotropowe – jego składowa normalna jest znacznie większa niż składowa styczna do powierzchni. Najsilniejszemu wzmocnieniu w widmie SERS ulegną te drgania, dla których zmienia się składowa polaryzowalności normalna do powierzchni. Dzięki temu na podstawie intensywności widma SERS można oszacować uśrednioną orientację cząsteczek względem powierzchni metalu.

4.2.4. Zastosowania spektroskopii SERS

Spektroskopia SERS znajduje bardzo wiele zastosowań. Czułość tej metody sięga obecnie poziomu pojedynczych molekuł (SMS, ang. single molecule spectroscopy), stąd jej duży potencjał w analityce czy bioanalityce. Opracowywane są nanosensory bazujące na widmie SERS, które służą do oznaczania pH, stężenia jonów metali w roztworze, zawartości substancji toksycznych; opatentowano na przykład wykorzystujący to widmo czujnik glukozy. Próbuje się także wykorzystać spektroskopię SERS jako narzędzie diagnostyczne w onkologii.

Aktualny przegląd zagadnień dotyczących zarówno opisu zjawiska SERS, jak i jego licznych zastosowań znaleźć można w artykułach przeglądowych .

Bibliografia

1. Fleischmann M., Hendra P.J., McQuillan A.J., Raman spectra of pyridine at a silver electrode, Chem. Phys. Lett. 1974, 26, 163.

2. Jeanmaire D.L., Van Duyne R.P., Surface Raman Spectroelectrochemistry, J. Electroanal. Chem. 1977, 84, 1.

3. Albrecht M.G., Evans J.F., Creighton J.A., Anomalously intense Raman spectra of pyridine at a silver electrode, J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 5215.

4. Bukowska J., Piotrowski P. w: Optical Spectroscopy and Computational Methods in Biology and Medicine, ed. M. Baranska, Springer, Germany 2014, s. 29–59.

5. Schlücker S., Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: Concepts and Chemical Applications, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 4756.