Zegary biologiczne - ebook

Przedmowa

W przedmowie do drugiego i trzeciego wydania mojej książki „Zegary biologiczne” z satysfakcją stwierdzałem, że – mimo upływu ponad pięciu lat od jej pierwszego wydania – ciągle zawiera ona aktualne informacje na temat rytmów biologicznych i leżących u ich podstaw zegarów.

Podobnie satysfakcjonujące stwierdzenie może się również znaleźć w przedmowie do obecnego (czwartego) wydania, które ukazuje się po ponad trzydziestu latach od wydania pierwszego. Nie oznacza to jednak, że tematyka rytmów biologicznych nie rozwijała się w tym czasie. Wręcz przeciwnie – dokonano wielu nowych, istotnych odkryć, które zostaną zaprezentowane w tym wydaniu książki.

O tym, że badania nad rytmami biologicznymi i mechanizmami zegara je kontrolującymi nieprzerwanie stanowią bardzo ważny dział nauk biologicznych, świadczy Nagroda Nobla przyznana niedawno trzem badaczom amerykańskim.

W Sztokholmie 2 października 2017 r. Komitet Noblowski ogłosił, że laureatami Nagrody Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny zostali trzej Amerykanie: Jeffrey C. Hall, Michael Rosbash i Michael W. Young. Odkryli oni molekularne mechanizmy kontrolujące rytmy okołodobowe organizmów. Więcej informacji Czytelnicy znajdą w Internecie (Gadomska 2017).

Z noblistami miała okazję współpracować polska badaczka prof. Jaga Giebułtowicz, która karierę naukową zaczynała na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego (ja zaś byłem promotorem jej rozprawy doktorskiej), a obecnie pracuje w Oregon State University w USA. Jak oceniła w rozmowie z PAP, wszyscy tegoroczni laureaci Nobla potrafili stworzyć wokół siebie zgrane zespoły badawcze, a w młodych współpracownikach rozpalili zapał do dalszej pracy naukowej. Nagroda Nobla to duże wyróżnienie i gratyfikacja dla badaczy dyscypliny, w której jest ciągle wiele do odkrycia (Giebultowicz 2018).

Kiedy w początkach lat 60. ubiegłego wieku rozpoczynałem badania nad rytmami biologicznymi owadów, było już po pierwszym międzynarodowym sympozjum, które odbyło się w 1960 r. w Cold Spring Harbor w Stanach Zjednoczonych. Do dzisiaj nie wiem, jak to się stało, że tom XXV z materiałami zjazdowymi tego sympozjum, zatytułowany „Biological Clocks”, znalazł się w bibliotece naszego Instytutu Zoologicznego UW. Był przez długie lata moją biblią, zawierał bowiem artykuły sławnych już wtedy badaczy rytmów roślin i zwierząt, takich jak: Colin S. Pittendrigh z Princeton University, Erwin Bünning z Uniwersytetu w Tybindze czy Jurgen Aschoff z Instytutu Maxa-Plancka w Niemczech, z którymi potem wielokrotnie się spotykałem przy różnych okazjach. Wówczas jednak najbardziej zafascynował mnie artykuł Janet E. Harker z Uniwersytetu w Cambridge, w którym autorka lokalizowała zegar biologiczny w dwóch neurosekrecyjnych komórkach zwoju podprzełykowego karalucha amerykańskiego(Periplaneta americana) (Harker 1960). I chociaż późniejsze badania licznych autorów nie potwierdziły tego odkrycia (Brady 1969), to praca ta pobudziła wyobraźnię wielu młodych badaczy wkraczających w zagadnienia rytmów biologicznych, także i moją.

Z chwilą gdy stało się jasne, że zegar biologiczny nie jest jakąś mistyczną funkcją organizmu, ale ma podłoże morfologiczne, rozpoczęto intensywne badania nad jego lokalizacją. Ja również dołączyłem do grona poszukujących w organizmach siedliska zegara kontrolującego rytmy biologiczne. Prowadząc badania na świerszczach domowych (Acheta domesticus), stwierdziłem, że główny mechanizm zegarowy kontrolujący dobową rytmikę aktywności lokomotorycznej tych owadów kryje się w ich mózgu, a ściślej w komórkach neurosekrecyjnych międzymózgowia (pars intercerebralis). Usunięcie tego ośrodka prowadzi do natychmiastowej utraty rytmu ich aktywności. Rytm ten można przywrócić, wykonując tak zwaną parabiozę owada nierytmicznego z rytmicznym (Cymborowski i Brady 1972) lub implantując do organizmu owada nierytmicznego mózg pobrany wraz z komórkami neurosekrecyjnymi od owada rytmicznego (Cymborowski 1981). Jest to możliwe, ponieważ w komórkach tych, zarówno in vivo, jak i in vitro, odbywa się rytmiczna synteza RNA (Cymborowski i Dutkowski 1969) oraz białek neurosekrecyjnych (Cymborowski i Dutkowski 1970b), które – uwalniając się w rytmie dobowym do hemolimfy owada – powodują zmianę jego zachowania (Cymborowski 1973, 1992).

Wiele lat później we współpracy z kilkoma ośrodkami zagranicznymi udało się stwierdzić, że w pars intercerebralis mózgu plujki pospolitej (Calliphora vicina) zlokalizowany jest nie tylko zegar biologiczny (Cymborowski i in. 1994), lecz także pozawzrokowe fotoreceptory odpowiedzialne za synchronizację jego pracy (Cymborowski i Korf 1995). Zegary kontrolujące rytmy dobowe odkryto również w innych narządach i tkankach owadów (Cymborowski i wsp. 1991, Giebultowicz 1999). Ponadto zostały one wykryte w różnych ośrodkach układu nerwowego kręgowców. U ssaków głównym ośrodkiem, w którym znajduje się zegar, jest jądro nadskrzyżowaniowe (łac. nucleus suprachiasmaticus – SCN) podwzgórza, natomiast u ptaków występuje on nie tylko w SCN, lecz także w szyszynce. W licznych przypadkach ośrodki te udało się przetransplantować z jednego organizmu do drugiego bez zakłócenia ich funkcji. Jeżeli np. młodym szczurom usunie się SCN, utracą one swój normalny rytm aktywności lokomotorycznej. Rytm ten pojawi się ponownie w ciągu 2–8 tygodni, jeżeli implantuje się im do trzeciej komory mózgu analogiczny ośrodek podwzgórza pobrany od szczurzych noworodków (Sawaki i wsp. 1984). Utratę rytmu aktywności lokomotorycznej u wróbli domowych (Passer domesticus) spowodowaną usunięciem szyszynki można łatwo przywrócić, implantując im ten organ pobrany od osobników normalnych, co już wcześniej wykazali Gaston i Menaker (1968).

Ośmielam się twierdzić, że podobnie jak ok. 30 lat temu, które upłynęły od pierwszego wydania moich „Zegarów biologicznych”, chronobiologia jest w dalszym ciągu dziedziną niezmiernie stymulującą rozwój biologii jako całości. W nowym wydaniu tej książki chciałbym to właśnie wykazać. Oczywiście nie sposób przedstawić całej problematyki związanej z rytmami biologicznymi, dlatego też szczególną uwagę zwrócę na ostatnie odkrycia w tej dziedzinie. Zostaną zatem przedstawione głównie współczesne próby odtworzenia i zrozumienia mechanizmu molekularnego zegara biologicznego.

Chronobiologia, w tym chronomedycyna (z grec. chronos – ‘czas’), pozwalają nie budzić się z migreną, szybciej przewalczyć grypę, lepiej sobie radzić z artretyzmem i rakiem. Powodują, że wielu chorób wręcz można uniknąć, a przyjmowane lekarstwa działają skuteczniej. Poznanie swojego rytmu nie jest trudne i przynosi zdumiewająco wiele korzyści. Ułatwia utrzymanie idealnej wagi, wskazuje najlepszy czas na ćwiczenia sportowe i działalność twórczą. Książka ta będzie m.in. zawierała wskazania, jak użyć swego wewnętrznego zegara w celach praktycznych.

Warszawa, 14.06.2019Rozdział 1. Wprowadzenie do rytmów biologicznych

Rys historyczny

W ostatnich latach obserwuje się duże zainteresowanie biologów mechanizmem „mierzenia” czasu przez organizmy żywe – zegarem biologicznym. Zjawisko to odkryto już w początkach XVIII wieku, a więc ma ponad dwuwiekową historię. W różnych opracowaniach można się natknąć na informację o skonstruowaniu, a ściślej – zasadzeniu zegara kwiatowego w Uppsali w latach 30. XVIII wieku przez Karola Linneusza. Tarcza tego żywego zegara była podzielona na 12 części, z których każdą wypełniały kwiaty otwierające się w danej godzinie. W pomysłowy sposób zostały tu po raz pierwszy wykorzystane obserwacje nad dobowym rytmem zakwitania różnych gatunków kwiatów. Zegar ten zaczynał wskazywać godziny wcześnie rano, kiedy to rozchylały się płatki kwiaty kozibrodu łąkowego, a kończył wieczorem, gdy zamykały się kwiaty liliowca. Podobne zegary, różniące się tylko składem gatunków tworzących je kwiatów, można by skomponować i w innych miejscach kuli ziemskiej.

Jak się to dzieje, że określone gatunki kwiatów zamykają się i rozchylają swoje płatki zawsze o określonej porze dnia? By odpowiedzieć na to pytanie, należałoby założyć, że mają one coś w rodzaju mechanizmu zegarowego mierzącego upływający czas. Od postawienia hipotezy o istnieniu zegara biologicznego do jej udowodnienia nauka odbyła długą i zawiłą drogę. Na samym jej początku leży przypuszczenie, że mierzenie czasu przez rośliny odbywa się na zasadzie funkcjonowania najprostszego czasomierza, jakim jest klepsydra. Wiadomo bowiem, że w organizmie żywym zachodzi szereg procesów biochemicznych, które zmieniają się w czasie, tak jak z upływem godzin zmienia się ilość piasku przesypującego się z jednego do drugiego naczynia klepsydry. Powstaje teraz pytanie, jakie siły uruchamiają zegar biologiczny i skąd bierze się energia do jego pracy? W przypadku klepsydry wystarczy takie jej ustawienie, aby naczynie z piaskiem było u góry, a już zacznie ona odmierzać czas. „Ustawienie” organizmu żywego, by zaczął on „wskazywać” pory doby, jest znacznie bardziej skomplikowane.

Przez długi czas uważano, że sygnałem uruchamiającym zegar biologiczny jest bodziec w postaci przejścia organizmu z okresu światła do okresu ciemności, a więc wschód słońca. Z chwilą zadziałania tego bodźca w organizmie zostaje zapoczątkowanych wiele skomplikowanych procesów biochemicznych, których początek lub koniec może się ujawnić w postaci określonego stanu organizmu, np. rozchylenia i stulenia płatków kwiatów. Tak więc uważano, że synchronizacja różnych procesów biologicznych w czasie odbywa się na zasadzie prostego schematu: bodziec–reakcja. Sądzono, że czynniki środowiska wywołują różnego typu oscylacje procesów fizjologicznych, podobnie jak zmiany nasłonecznienia powodują powstawanie cykli temperaturowych w świecie nieorganicznym.

Chociaż początkowe obserwacje dotyczyły roślin, podobne tezy na temat synchronizacji procesów fizjologicznych wysuwano również w stosunku do zwierząt.

Obecnie nagromadzono dostatecznie dużo dowodów na to, by twierdzić, że wszystkie organizmy żywe, a więc nie tylko wielokomórkowe, ale i jednokomórkowe, mierzą czas na innej zasadzie, a mianowicie poprzez działanie wewnętrznych (endogennych) procesów cyklicznych, rytmicznie powtarzających się w ciągu doby. Do zapoczątkowania tych procesów nie jest konieczny bodziec pochodzący ze środowiska zewnętrznego. Zagadnieniom tym zostanie poświęcone sporo uwagi w dalszych rozdziałach tej książki. Spróbujemy również odpowiedzieć na pytanie, co daje organizmowi posiadanie takiego typu zegara. Tymczasem ograniczymy się tylko do stwierdzenia, że zegary działające na zasadzie cykli dobowych umożliwiają gromadzenie, a następnie przechowywanie przez odpowiednio długi okres pochodzących ze środowiska informacji. Nawet wtedy, gdy przez pewien czas nie docierają one do organizmu.

Dla zobrazowania tego, co powiedzieliśmy na temat endogennego zegara biologicznego, posłużmy się kilkoma przykładami wybranymi z historii badań w tym zakresie.

Otóż już ponad dwieście lat temu badacze stwierdzili, że do przebiegu pewnych procesów biologicznych zmieniających się w cyklu dobowym nie jest konieczne rytmiczne oddziaływanie bodźców środowiska, przede wszystkim światła i ciemności. Pierwszym, który ten fakt zaobserwował – już w 1729 r. – był francuski geofizyk Jean Baptiste Dortous de Mairan. Przy zastosowaniu bardzo prostego urządzenia składającego się z kimografu oraz odpowiednio zawieszonej dźwigni (ryc. 1) rejestrowano w sposób ciągły ruchy liści. Dzięki tej metodzie stwierdzono, że rośliny trzymane w stałej ciemności i w stałej temperaturze, a więc bez działania najważniejszych dawców czasu środowiska, posiadają wyraźną rytmikę dobową ruchów liści, zbliżoną bardzo do tej, jaką obserwowano w warunkach naturalnie zmieniającego się światła i ciemności oraz przy działaniu dzienno-nocnych cykli temperaturowych. Dobowe ruchy liści roślin trzymanych w takich warunkach ilustruje rycina 2. Jak widać z danych zamieszczonych na tej rycinie, zastosowanie stałej ciemności po okresie zmiennego oświetlania nie zaburza rytmiki dobowej ruchów liści kanawalii mieczokształtnej (Canavalia ensiformis) (Kleinhoonte 1932).

Ryc. 1. Sposób rejestracji ruchów liści fasoli na obracającym się walcu kimografu

Tak więc pierwszy, istotny krok ku poznaniu endogennych rytmów biologicznych, został zrobiony i – jak powiedział Bünning w 1960 r. na otwarciu międzynarodowego sympozjum poświęconego zegarom biologicznym – zastanawiające jest, że dokonał tego astronom interesujący się szczególnie obrotem kuli ziemskiej dookoła własnej osi. Moglibyśmy więc adaptacje żywych organizmów do środowiska śmiało nazwać adaptacjami do obrotowego ruchu ziemi.

Ryc. 2. Rytmika ruchów liści Canavalia ensiformis w warunkach zmieniających się światła i ciemności oraz w warunkach stałej ciemności. Okresy ciemności są szare (wg Kleinhoonte 1932)

Dalsze badania szły w kierunku potwierdzenia obserwacji poczynionych nad ruchami liści przez de Mairana. Dążono do eliminacji wszystkich czynników środowiska zewnętrznego mogących mieć wpływ na ruchy liści. W tym celu umieszczano rośliny nawet w jaskiniach. Jak się okazało, tak odizolowane od bodźców środowiska rośliny w dalszym ciągu wykazywały istnienie rytmiki ruchów liści, takiej samej jak przed doświadczeniem lub podobnej (Zinn 1759). Wielu późniejszych badaczy potwierdziło te obserwacje. Między innymi Pfeffer (1875) wysunął przypuszczenie, że ruchy liści roślin charakteryzują się wrodzoną dobową okresowością.

Bünning (1960) cytuje wielu innych badaczy XVIII i XIX wieku, którzy doszli do podobnych stwierdzeń. Wśród nich na uwagę zasługuje Karol Darwin, który w wydanej w 1880 r. książce, zatytułowanej „The Power of Movement in Plants”, podkreśla „wrodzony” charakter rytmiki dobowej. Wynika to m.in. z jego stwierdzenia: „we may conclude that the periodicity of their movements is to a certain extent inherited”.

Wykazanie w latach 1729–1880 istnienia endogennej rytmiki ruchów liści roślin nie równało się jednak z przyjęciem istnienia i działania zegara biologicznego. Wtedy nie było jeszcze do pomyślenia, by dobowe ruchy liści uznać za przejaw działania wewnętrznego mechanizmu, tak jak ruch wskazówek zegara uznajemy za przejaw jego „chodu”.

Istotnie, oscylacje zachodzące w rytmie 24-godzinnym mogą być nazwane zegarami tylko w sytuacji, gdy konkrentne rośliny są używane do mierzenia czasu (Bünning 1960). Zrozumiałe jest więc, że w tych początkowych badaniach nie odróżniano wskazówek zegara od jego mechanizmu. Być może nieszczęśliwie się złożyło, że pierwsze prace dotyczyły rytmiki ruchów liści i nie widziano w niej żadnych cech adaptacyjnych ani czynnika, który mógłby odgrywać jakąkolwiek rolę w procesie ewolucji. Był to przecież okres (1859), kiedy Darwin ogłosił zasady ewolucji organizmów przez dobór naturalny.

Obecnie już wiemy, że poza ruchami liści ogromna większość procesów fizjologicznych organizmów żywych jest kontrolowana przez zegar biologiczny, który z pewnością odgrywa ważną rolę jako czynnik doboru naturalnego. O zagadnieniach tych będzie jeszcze wielokrotnie mowa.

W początkach XX wieku różni badacze poświęcili wiele czasu na poszukiwanie czynnika, który powoduje, że w stałych warunkach środowiska rośliny wykazują rytm dobowy ruchów liści. Podejrzewano, że czynnikiem tym mogą być subtelne zmiany temperatury. Jednakże, jak stwierdzono w znacznie późniejszych badaniach (Bünning 1967), nawet zmiany temperatury w zakresie 10–25°C nie zaburzają dobowego rytmu ruchów liści. Natomiast, jak się okazało – wszystkie rośliny wykazują reakcję w postaci zmiany rytmu ruchów liści po zastosowaniu sztucznego fotoperiodu. Jednakże i tutaj występuje pewien krytyczny okres oświetlenia, poniżej którego nie obserwuje już się żadnego wpływu na przebieg tego rytmu. Na przykład dla fasoli (Phaseolus multiflorus) taki krytyczny fotoperiod wynosi 9 godzin, co oznacza, że poniżej tej wartości światło nie oddziałuje na przebieg rytmu dobowego ruchów liści (Bünning 1957).

Wpływ fotoperiodu powyżej krytycznej długości na rytm dobowy ruchów liści polega przede wszystkim na przesuwaniu jego fazy – czyli fotoperiod taki synchronizuje pracę zegarów biologicznych. Mówiąc obrazowo, jest w stanie przesuwać „wskazówki” tego zegara, natomiast nie ma wpływu na sam mechanizm zegarowy.

Tego typu czynnikom, które synchronizują pracę zegarów biologicznych, a więc spełniają rolę wskaźników czasu, poświęcimy sporo uwagi podczas omawiania czynników środowiskowych wpływających na procesy rytmiczne organizmu.

Autorzy pierwszych prac poświęconych zagadnieniom zegarów biologicznych nie zajmowali się wyłącznie badaniem ruchów liści roślin. Bardzo wcześnie stwierdzono również istnienie rytmów dobowych u zwierząt. Należy tu odnotować obserwacje poczynione już w 1894 r. przez Kiesela, które dotyczyły rytmiki zmian ubarwienia skorupiaków (wg Bünninga 1960). Badacz ten wykazał, że dobowe zmiany ubarwienia stawonogów są natury endogennej, co oznacza, że zachowują one swój charakterystyczny rytm w stałych warunkach otoczenia.

Dalsze obserwacje dokonywane na zwierzętach, podobnie jak to było w przypadku roślin, szły w kierunku gromadzenia przykładów dobowych rytmów endogennych. Wkrótce też wykazano, że szereg procesów fizjologicznych zwierząt przebiega w rytmie dobowym i że są one regulowane na drodze endogennej. Przykładowo można tu wymienić takie procesy, jak: aktywność ruchowa szczurów (Słonaker 1907, Richter 1922), aktywność ruchowa owadów (Szymański 1914, Lutz 1932), zawartość glikogenu w wątrobie królika (Forsgren 1928), linki imaginalne owadów (Bünning 1935). W pracach tych, jak i w wielu innych, starano się wszelkimi możliwymi sposobami zakłócić obserwowane procesy rytmiczne. W tym celu stosowano w hodowlach różnych zwierząt przez wiele pokoleń nienaturalne cykle światła i ciemności (np. 8 godzin światła i 8 godzin ciemności), stałe oświetlenie czy stałą ciemność! (Wolf 1930, Park i Keller 1932, Wahl 1932). We wszystkich tych przypadkach ujawniała się wyraźna rytmika dobowa badanych procesów. Utrzymywanie nienormalnych warunków w hodowli muszki owocowej (Drosophila melanogaster) przez 15 kolejnych pokoleń nie zakłóciło endogennej rytmiki dobowej linek imaginalnych tych owadów (Bünning 1935).

Dalszych dowodów na to, że organizmy dziedziczą zdolność ujawniania endogennych rytmów, dostarczyły badania Aschoffa (1955), który przez 6 pokoleń hodował myszy w warunkach stałego oświetlenia, nie stwierdzając zmiany w spontanicznej aktywności ruchowej. Również jaszczurki hodowane od jaja w warunkach stałego oświetlenia lub stałej ciemności wykazywały charakterystyczną dla tego gatunku rytmikę spontaniczną (Hoffmann 1957a). Podobnie nie udało się zakłócić rytmiki aktywności ruchowej oślepionych przez przecięcie nerwów wzrokowych szczurów, hodowanych przez ponad 20 miesięcy (Richter 1964).

Sprawą dotychczas niewyjaśnioną pozostaje, czy zegary biologiczne są przekazywane następnym pokoleniom „na chodzie”, czy też do ich uruchomienia potrzebne jest jednorazowe zadziałanie bodźców środowiska (Humiński 1969).

Cechy charakterystyczne rytmów dobowych

Rytmy biologiczne można by przyrównać do ruchu wahadła zegarowego, które zmieniając swoje położenie, przechodzi przez te same punkty przestrzeni, podobnie jak to jest w przypadku wzrostu i spadku określonych procesów biologicznych. Można je także przyrównać do poruszającego się koła (ryc. 3), na którym zaznaczono punkt zmieniający swoje miejsce w czasie i przestrzeni podczas przechodzenia z położenia A w położenie B. Amplituda rytmu jest w tym przypadku równa średnicy koła i jest niezależna od czasu. Natomiast do przejścia od A do B niezbędny jest pewien czas, nazywany okresem rytmu – τ. Jak długo koło będzie poruszało się do przodu z tą samą prędkością, tak długo okres rytmu nie będzie ulegał zmianie. Natomiast gdy prędkość zmaleje lub wzrośnie, wtedy również zmaleje lub wzrośnie częstotliwość oscylacji, czyli liczba obrotów koła w jednostce czasu, co pociągnie za sobą zmianę okresu rytmu.

Ryc. 3. Zasady oscylacji i cykliczności. Linia pogrubiona oznacza krzywą sinusoidalną, którą zakreśla punkt A, wędrując po obwodzie koła w czasie jego obrotu. Ponieważ zwykle rytmy biologiczne nie przebiegają symetrycznie, celowo zmieniono proporcje między amplitudą a okresem rytmu. Dalsze objaśnienia w tekście

Jakiekolwiek położenie punktu na krzywej przebiegu rytmu określa jego fazę. Mówimy zatem np. o fazie maksymalnej czy minimalnej aktywności ruchowej zwierząt, maksymalnym natężeniu fotosyntezy, minimum aktywności enzymatycznej itp. Jeśli w wyniku działania określonych czynników środowiska interesująca nas faza rytmu ulega „przyspieszeniu” lub „opóźnieniu”, to mówimy wtedy o przesuwaniu fazy rytmu.

Wiele dotychczas poznanych rytmów biologicznych (dobowy rytm ruchów liści, temperatura ciała człowieka itp.) można przedstawić w postaci krzywej sinusoidalnej, a to ze względu na opisujące ją równanie: x = r sin ωt, gdzie x to odchylenie od średniej (linii środkowej), r – amplituda rytmu, ω – prędkość kątowa okręgu, t – czas.

Niektórzy badacze uważają, że równanie to stanowi podstawową charakterystykę wszystkich rytmów biologicznych. Jednakże wyniki doświadczeń rzadko potwierdzają tę regułę i dlatego też na rycinie 3 zmieniono proporcje między amplitudą a okresem rytmu.

Również fizycy inaczej określają amplitudę rytmu (przyjmując promień, a nie średnicę koła). Wydaje się, że nie ma istotnych powodów, by procesy biologiczne charakteryzować tylko za pomocą takiej krzywej. Dla przykładu – wiadomo, że u roślin liście nie tylko poruszają się w górę i w dół (patrz ryc. 1), lecz także wykonują pewne dodatkowe ruchy w obu tych skrajnych położeniach. Tak samo modyfikacji ulega dobowa zmiana temperatury w zależności od spożywania posiłków. Wydaje się więc, że kształt krzywej opisujący rytmy biologiczne nie jest ważny. Ważną rzeczą jest za to stwierdzenie, że zegary biologiczne funkcjonują na zasadzie oscylacji. Używając zatem terminu rytm, mamy na myśli oscylację określonego procesu biologicznego zmieniającego się w czasie.

Jedną z poznanych już cech rytmów przeważającej większości różnych badanych procesów fizjologicznych organizmu jest ich endogenny charakter. Podkreślmy jeszcze, że do zapoczątkowania przebiegu tych procesów nie jest konieczny bodziec pochodzący ze środowiska zewnętrznego.

Jakie procesy życiowe organizmu można uznać za przejaw pracy jego wewnętrznego czasomierza? Otóż zanim zaczniemy śledzić „chód” zegarów biologicznych na podstawie wybranych procesów życiowych zwierząt, musimy stwierdzić, że nie znamy żadnej czynności organizmu, która by przebiegała niezależnie od innych, dlatego też trudno mówić o jednym procesie. Na przykład aktywność ruchowa zwierząt jest powszechnie uważana za przejaw działalności ich wewnętrznego mechanizmu czasowego, a przecież wiemy, ile różnych czynników wchodzi w jej zakres. Czy oznacza to, że wszystkie one mogłyby dostarczać nam informacji o pracy tego mechanizmu? Prawdopodobnie tak – gdybyśmy tylko potrafili śledzić ich przebieg w czasie.

Inną bardzo charakterystyczną cechą jest to, że wszystkie dotychczas zbadane w warunkach stałych procesy rytmiczne nie zmieniają się w cyklu ściśle dobowym, tzn. 24-godzinny rytm obserwuje się tylko wtedy, gdy organizmy są hodowane w zmieniających się warunkach światła i ciemności (dnia i nocy). Natomiast po zastosowaniu warunków stałych (np. stałej ciemności czy stałego oświetlenia), to jest warunków, w których ujawnia się praca wewnętrznego zegara biologicznego, przebieg różnych procesów życiowych wykazuje odchylenie od okresu 24-godzinnego. Na przykład ruchy liści fasoli w stałej ciemności odbywają się w rytmie 25–26-godzinnym (Bünning i Stern 1930), mimozy (Mimosa pudica) zaś w rytmie 22–23-godzinnym (Bünning 1958). Aktywność ruchowa karalucha amerykańskiego (Periplaneta americana) w takich warunkach wykazuje cykl 24,5-godzinny (Szymański 1914). Według Bruce (1960) zakres tych wahań dla różnych organizmów mieści się w granicach 20–28 godzin, tzn. ujawniająca się w stałych warunkach rytmika ma okres nie krótszy od 20 godzin i nie dłuższy od 28 godzin.

Na podstawie wyników różnych i licznych badań Aschoff (1952, 1958, 1959) stwierdził istnienie pewnej reguły: zwierzęta o nocnym trybie życia umieszczane w stałej ciemności wykazują rytm krótszy od 24 godzin, umieszczone zaś w stałym świetle – dłuższy. Odwrotnie zachowują się zwierzęta o dziennym typie aktywności. Halberg (1959) zaproponował dla rytmów dobowych termin circadian (z łac. circa – około, dies – dzień). Tak więc omawiane tu rytmy powinniśmy nazywać rytmami okołodobowymi, ponieważ ich okres jest dłuższy lub krótszy od 24 godzin. Dla uproszczenia w dalszej części tej książki będzie używany termin „dobowy”, ponieważ dla wykazania, że mamy do czynienia z rytmem okołodobowym, niezbędne są specjalne badania (będzie o tym mowa w rozdziale 2).

W stałych warunkach środowiska ujawnia się jeszcze jedna cecha charakterystyczna dla rytmiki dobowej, a mianowicie jej spontaniczność (z ang. Free-Running Rhythm). Oznacza to, że w warunkach środowiska pozbawionego wyznacznika czasu rytmika dobowa danego procesu nie ulega zaburzeniu, natomiast występuje tzw. zjawisko dryfowania. Polega ono na tym, że początek i zakończenie określonej fazy rytmu stopniowo przesuwa się w czasie w stosunku do godzin czasu lokalnego. W dalszych rozdziałach tej książki postaramy się odpowiedzieć na pytanie: co daje organizmowi posiadanie tego typu zegara biologicznego? Obecnie poprzestaniemy na stwierdzeniu, że jest to niezwykle ważna cecha umożliwiająca organizmowi precyzyjne zaadaptowanie się do warunków środowiska, w którym żyje.

W przypadku wielu organizmów nie bardzo jeszcze wiadomo, gdzie znajduje się zegar biologiczny i czy jest to właściwość całego organizmu, czy tylko określonej grupy komórek wchodzących w jego skład.

Wielu badaczy umiejscawia zegar biologiczny w ośrodkowym układzie nerwowym zwierząt (Slonim 1961, Cymborowski 1970a), w którym rytmiczne pobudzenia są przyczyną obserwowanej rytmiczności różnych zjawisk życiowych tych organizmów. Inni zaś, np. Grodziński (1962), przypisują ważną rolę w tym zakresie układowi pokarmowemu. W tym przypadku rytmiczność powstawałaby jako następstwo stanu nasycenia i głodu. Potwierdzałyby to badania rozwoju rytmu dobowego snu i czuwania u dzieci (Kleitmen 1949; Mills 1966). Zagadnieniom lokalizacji zegara biologicznego poświęcimy jeszcze sporo uwagi.

Istotnym odkryciem było stwierdzenie, że przebieg rytmiki dobowej różnych badanych procesów fizjologicznych nie ulega zmianie w dużym przedziale temperaturowym (Hastings i Buck 1956, Hastings i Sweeney 1957, Sweeney i Hastings 1960). Fakt ten przemawia za tym, że pojęcie zegara biologicznego nie jest ogólną koncepcją wynikającą z właściwości metabolicznych organizmu, lecz ma naturę biofizyczną.

Na koniec dodajmy jeszcze jedną bardzo ważną cechę rytmów biologicznych, a mianowicie to, że sterujący nimi zegar stale „chodzi” bez względu na zmiany warunków środowiska. W dalszych rozważaniach postaramy się przedstawić dowody na poparcie tego stwierdzenia. Zastanowimy się również nad wpływem środowiska na funkcjonowanie zegara biologicznego. Chwilowo zadowolimy się wyjaśnieniem, że rytmiczne zmiany warunków środowiska wpływają na zegar biologiczny tylko jako czynnik synchronizujący jego pracę, coś w rodzaju siły przesuwającej jego „wskazówki”. Rytmicznie działające czynniki środowiska, które są w stanie synchronizować procesy endogenne organizmu, zostały nazwane Zeitgeber (Aschoff 1951, 1954) lub synchronizatorami (Halberg 1954). W światowym piśmiennictwie powszechnie używany jest termin „Zeitgeber”, co w przekładzie na polski znaczy ‘dawca czasu’ i tak też będzie ten termin stosowany w tej książce.

W podsumowaniu cech charakterystycznych rytmów dobowych roślin i zwierząt zapamiętajmy, że 1) mają one endogenny charakter, co oznacza, że powstają w samych organizmach, a nie na skutek działania czynników zewnętrznych; 2) w stałych warunkach środowiska ujawniają się rytmy spontaniczne o cyklu zbliżonym do doby (stąd zwane są rytmami okołodobowymi); 3) nie podlegają istotnym zmianom w dość dużym zakresie wahań temperatury; 4) zegar biologiczny kontrolujący je odmierza czas stale, bez względu na zmiany środowiska i 5) zegar ten jest dziedziczony przez kolejne pokolenia.

Wieloznaczność terminu „rytm okołodobowy”

Rytm okołodobowy (circadian) ma różne znaczenie dla różnych badaczy. Jedni autorzy używają tego terminu do oznaczenia wszystkich rytmów biologicznych, których okres trwania wynosi ok. 24 godzin (Halberg i in. 1959). Natomiast inni (Aschoff 1960, Pittendrigh 1960) stosują go do oznaczania tylko rytmów endogennych, wykluczając tym samym wszystkie rytmy egzogenne. Wurtman (1967) poddaje ostrej krytyce stanowisko badaczy należących do pierwszej grupy. Cytuje on prace, w których wykazano istnienie niektórych rytmicznych procesów fizjologicznych pozostających w ścisłej zależności od warunków środowiska, w związku z czym nie można ich nazywać rytmami okołodobowymi.

Gdy wprowadzono ten termin (1959 r.), w pracach dotyczących rytmiki dobowej opisywano pewne zjawiska, które łatwo było obserwować u jednego i tego samego zwierzęcia czy tej samej rośliny. Na przykład aktywność ruchową zwierząt czy ruchy liści można było śledzić przez szereg kolejnych dni czy miesięcy. Ustalenie zatem, czy rytmika tych procesów jest egzo-, czy endogenna nie nastręczało większych trudności. To samo odnosi się do rytmu temperatury ciała organizmu czy wielu innych tego typu procesów.

Obecnie badacze coraz częściej podejmują innego typu prace nad rytmami dobowymi. Przede wszystkim chodzi o zbadanie rytmiki różnych procesów zachodzących w poszczególnych tkankach organizmu, dobowych zmian w aktywności enzymów itp. Tego typu prace wymagają często uśmiercenia wielu zwierząt doświadczalnych. Typowy przykład takiego eksperymentu wygląda tak: grupę zwierząt synchronizuje się w określonych warunkach pod względem dawcy czasu, a następnie pobiera się materiał do badań w ściśle ustalonych odstępach czasu (zwykle w ciągu doby). Następnie uśrednia się co 2–4 godziny wyniki danych uzyskanych na podstawie materiału pobranego od grupy zwierząt o tej samej godzinie doby. Wyniki wszystkich dobowych analiz porównuje się ze sobą. Jeżeli tak uzyskane dane na temat badanego procesu wykazują istnienie jednego maksimum i jednego minimum, to taki rytm możemy nazywać rytmem dobowym lub 24-godzinnym (Cymborowski 1970b).

Znacznie trudniej jest prowadzić badania wyżej wymienionych procesów w celu stwierdzenia rytmu okołodobowego (spontanicznego). Zagadnienia te będą szczegółowo omówione w części dotyczącej metodyki badań. Aby wykazać, że dany proces fizjologiczny przebiega w rytmie okołodobowym, należałoby przede wszystkim dużą grupę zwierząt umieścić w stałych warunkach światła lub ciemności, w celu pozbawienia ich wskaźników czasu. Po takim przygotowaniu zwierząt przeprowadzamy badania interesującego nas procesu. Jeżeli mimo nieobecności Zeitgebera w warunkach, w których przebywały zwierzęta, badany w nich proces fizjologiczny wykazuje cechy rytmu dobowego w okresie mniejszym lub większym od 24 godzin, to dopiero wtedy jesteśmy upoważnieni do użycia terminu „okołodobowy”. Tymczasem w ostatnich latach ukazało się wiele prac zatytułowanych „Rytm okołodobowy...”, w których nie przeprowadzono tego typu testów. W takich przypadkach znacznie bezpieczniej jest stosować termin „rytm dobowy” czy „rytm 24-godzinny”. Oczywiście użycie tych terminów nie wyklucza istnienia rytmu okołodobowego badanych procesów, jednakże do jego wykazania niezbędne są dalsze bardzo pracochłonne eksperymenty.

Podstawowa terminologia rytmów dobowych

Ze względu na to, że od opisu procesów rytmicznych wprowadzono szereg specyficznych terminów, które w polskim piśmiennictwie są jeszcze mało znane, postanowiono zamieścić ważniejsze z nich z podaniem krótkiej definicji. Wydaje się to celowe ze względu na fakt, że w kolejnych rozdziałach tej książki będą one stale używane.

1. Chronobiologia – dziedzina nauki zajmująca się rytmami biologicznymi (biorytmami). Chronobiologia zajmuje się więc zagadnieniami zmian zjawisk biologicznych w czasie, dążąc do pełnego opisu struktury czasu biologicznego. W pojęcie „struktury czasu biologicznego” wchodzi wiele różnych, dających się przewidywać, zmian zachodzących w grupie organizmów, w organizmie jako całości czy w jego tkankach, układach i komórkach łącznie ze strukturą submikroskopową. Według Halberga (1969) w skład chronobiologii wchodzą następujące dyscypliny:
1. Chronofizjologia – ustala charakterystykę czasową procesów fizjologicznych leżących u podstaw rytmiki zachowania się zwierząt,
2. Chronotoksykologia – zajmuje się wpływem czynników chemicznych i fizycznych na rytmikę zjawisk biologicznych,
3. Chronopatologia – badania zmian czasowych zjawisk biologicznych wywoływanych procesami chorobowymi,
4. Chronofarmakologia – badanie wpływu środków farmakologicznych na przebieg rytmicznych zmian biologicznych.

2. Rytm – powtarzalność przebiegu różnych procesów życiowych organizmów roślinnych i zwierzęcych.

3. Rytm dobowy – powtarzanie się nasilenia przebiegu procesów życiowych co 24 godziny.

4. Rytm okołodobowy (circadian) – powtarzanie się przebiegu procesów życiowych w przybliżeniu co 24 godziny. Wyróżniamy tu rytmy krótsze i dłuższe od 24 godzin.

5. Rytm egzogenny – rytm ujawniający się w obecności rytmicznie zmieniających się bodźców środowiska. Rytmy te powstają na zasadzie prostego układu: bodziec–reakcja. W stałych warunkach środowiska rytm taki się nie ujawnia.

6. Rytm endogenny – rytm powstający pod wpływem bodźców pochodzących z samego organizmu. Cechą charakterystyczną tego rytmu jest jego trwanie nawet wtedy, gdy z otoczenia zwierzęcia usuniemy wszystkie rytmicznie zmieniające się czynniki środowiska.

7. Rytmika spontaniczna – wolnoprzebiegająca (free running rhythm) rytm endogenny – ujawnia się w warunkach stałych środowiska. Do jego wykazania niezbędne jest zbadanie określonej ilości niezmienionych oscylacji.

8. Oscylacja – zmiana natężenia przebiegu określonego procesu w czasie.

9. Zakres oscylacji – różnica między maksimum a minimum.

10. Oscylator – mechanizm wywołujący oscylacje. Określenie to często jest używane jako synonim zegara biologicznego.

11. Amplituda rytmu – stopień odchylenia danego procesu od stanu przeciętnego. Na przykład aktywność ruchowa zwierząt nocnych wzmaga się w nocy, a słabnie w dzień; dzienne i nocne odchylenia od średniej dobowej to właśnie amplituda rytmu.

12. Okres – przedział czasu, po którym następuje powtórzenie się określonego stanu badanego procesu. W przypadku ciągłego procesu jest to przedział czasu między dwoma kolejnymi szczytami lub kolejnymi obniżeniami.

13. Częstotliwość – powtarzanie się okresu rytmu czy oscylacji.

14. Cykl – jeżeli badany przez nas proces po zajściu w nim szeregu zjawisk wraca do stanu wyjściowego, to określamy go „cyklem”. W pracach dotyczących rytmów dobowych często używa się tego terminu jako synonimu okresu rytmu.

15. Faza rytmu – odpowiedni stan oscylacji w okresie.

16. Przesunięcie fazy rytmu – przemieszczenie się oscylacji na osi czasu.

17. Dryfowanie rytmu – przyspieszenie lub opóźnienie określonej fazy rytmu w następujących po sobie dniach.

18. Rytm przejściowy – stan czasowej oscylacji między dwoma stałymi stanami.

19. Zegar biologiczny – wewnętrzny mechanizm organizmu kierujący dobową rytmiką procesów (patrz oscylator).

20. Synchronizacja – stan, w którym dwie lub więcej oscylacji ma tę samą częstotliwość.

21. Synchronizator (Zeitgeber – dawca czasu) – wskaźnik czasu dla organizmu – czynnik środowiska mający zdolność wpływu na pracę zegara biologicznego.

22. Powstawanie rytmu (z ang. entraiment) – proces prowadzący do wytworzenia określonej rytmiki dobowej. Przykładem może być proces powstawania rytmu dobowego w warunkach odwróconego fotoperiodu (w miejsce dnia stosuje się ciemność).

23. ESSO (endogenous self-sustaining oscillator) – wewnętrzny samopodtrzymujący się oscylator – synonim zegara biologicznego.

24. ESSO A (zegar nadrzędny, oscylator A) – mechanizm mający za zadanie dokonywanie analizy bodźców dopływających ze środowiska zewnętrznego, przede wszystkim synchronizatorów.

25. ESSO B (zegar podrzędny, oscylator B) – system regulowany przez ESSO A. Układ wrażliwy na zmiany temperatury.

26. Chronon – określony odcinek DNA składający się z szeregu operonów, które w sposób cykliczny produkują określone rodzaje białek. Cały cykl pracy chrononu powtarza się w przybliżeniu co 24 godziny.

27. Symbole:

L (light) – światło, fotoperiod

D (dark) – ciemność

LD – cykl światła i ciemności. Składa się on z pewnej liczby godzin światła i ciemności w ciągu doby. Przy tym oznaczeniu często jeszcze podaje się natężenie światła w okresie fotoperiodu i w okresie ciemności. Zwykle w tym ostatnim jest ono niemożliwe do zmierzenia.

LD 12:12 – cykl składający się z 12 godzin światła i 12 godzin ciemności.

LD 16:8 – cykl składający się z 16 godzin światła i 8 godzin ciemności itp.

LL – stałe oświetlenie

DD – stała ciemność

τ – okres rytmu czy oscylacji

Φ – akrofaza (wartość maksymalna określonego rytmu)

f – częstotliwość oscylacji

t – czas w godzinach

ω – częstotliwość kątowa (360°:24 godz. = 15°/godz.), oblicza się ją często w celu ustalenia fazy rytmu

SE – błąd standardowy

C – amplituda rytmu

Co – wartość średnia rytmu.

Ten krótki opis rytmów dobowych organizmów żywych ma za zadanie przedstawienie Czytelnikowi podstawowych problemów i zagadnień wiążących się z funkcją zegara biologicznego. W następnych rozdziałach tej książki będą one rozpatrywane bardziej szczegółowo. Postaramy się przedstawić aktualny stan badań w tym zakresie oraz współczesne poglądy na zagadnienie rytmów dobowych.Rozdział 2. Metodyka badań rytmów dobowych

Praktycznie wszystkie metody stosowane w badaniach biologicznych mogą być zaadaptowane do badań nad rytmiką dobową, jednakże muszą spełniać dodatkowe warunki. Przede wszystkim muszą one zapewnić możliwość gromadzenia informacji przez odpowiednio długi czas, przynajmniej w ciągu kilku kolejnych dni.

Najprostszymi metodami badań rytmiki dobowej są bezpośrednie obserwacje, w których badacz obserwuje i zapisuje zmiany określonych zjawisk w ciągu doby, przy czym mogą to być obserwacje prowadzone ciągle lub w pewnych przedziałach, np. co pół godziny, godzinę itp.

Metoda ta była i jest nadal stosowana do badań rytmiki dobowej aktywności lokomotorycznej zwierząt. W ten sposób badano aktywność ruchową niektórych chrząszczy (Park i Keller, 1932, Greenslade 1963), jętek (Harker 1953) i kilku gatunków pająków (Breymeyer 1965, Horn 1969). Bezpośrednią obserwację zastosowano również w badaniach dobowej reakcji muchy tse-tse (Glossina morsitans Westw.) na poruszające się w jej polu widzenia obiekty (Brady 1972a). Jednakże metoda ta ma wiele niekorzystnych cech. Przede wszystkim istnieje możliwość popełniania dużych błędów, powodowanych samym zmęczeniem obserwatora, które występuje przy prowadzeniu ciągłej obserwacji.

Inną niekorzystną cechą tej metody, bardzo ograniczającą jej przydatność do badań rytmiki dobowej zwierząt, jest konieczność stosowania oświetlenia w okresie, kiedy normalnie trwa noc. W przypadku badań nad rytmiką dobową owadów powszechnie do tego celu stosuje się światło czerwone. Według Burkhardta (1964) większość owadów nie reaguje na tę długość fal. Jednakże nie należy zbyt uogólniać zagadnienia. Dla przykładu można podać, że niektóre gatunki much z rodziny Calliphora są wrażliwe na fale świetlne o długości 630 mμ (Dethier 1963). Podobne wyniki uzyskał Callahan (1965), który dodatkowo stwierdził, że liczne gatunki owadów mogą reagować na czerwone światło niekoniecznie przy udziale narządów wzrokowych, lecz także i innych receptorów umieszczonych na ciele.

Podobne badania w tym zakresie nie są pełne w odniesieniu do innych grup zwierząt, w tym również kręgowców. Ogólnie przyjmuje się, że spektrum widzialne zwierząt kręgowych, w tym także człowieka, leży w granicach 390–760 mµ (Marler i Hamilton 1966). Należy jednak zaznaczyć, że występują tu duże różnice w zależności od trybu życia zwierzęcia.

Pewną odmianą wizualnej obserwacji aktywności zwierząt jest metoda odłowów, szczególnie powszechnie stosowana w badaniach ekologicznych. W ogólnych zarysach polega ona na odpowiednim ustawieniu pułapek w terenie i sprawdzaniu ich zawartości w ustalonych odstępach czasu. W badaniach rytmiki dobowej pułapki w postaci cylindrów zakopanych w ziemi stosowano przy określaniu aktywności naziemnych chrząszczy (Williams 1959). W przypadku innych owadów, takich jak komary czy ćmy, stosowano pułapki chwytające je w locie (Corbet 1960).

Wiele tego typu prac wykonano również na kręgowcach. Na przykład Jansky i Hanak (1960) badali aktywność dobową ryjówki aksamitnej (Sorex araneus L.) w warunkach naturalnych.

Najwięcej prac dotyczących rytmiki dobowej różnych procesów życiowych zwierząt wykonano w warunkach laboratoryjnych. W dalszym ciągu przedstawimy więc podstawowe zasady eksperymentów prowadzonych w tym zakresie w warunkach sztucznych. Należą do nich: odpowiednie przygotowanie zwierząt, gromadzenie wyników oraz ich statystyczne opracowanie.