Koronawirus SARS-CoV-2 zagrożenie dla współczesnego świata - ebook

5
DIAGNOSTYKA ZAKAŻEŃ SARS-COV-2

5.1. Diagnostyka molekularna i serologiczna zakażeń SARS-CoV-2

Tomasz Dzieciątkowski

Choroba COVID-19 spowodowała zakażenia na całym świecie i pochłonęła życie milionów ludzi, głównie w USA i Europie. Według aktualnej wiedzy dotyczącej pochodzenia i ewolucji koronawirusa SARS-CoV-2, który wywołuje chorobę, potencjalnym jego rezerwuarem są nietoperze. Nowy koronawirus przełamał barierę gatunkową i znalazł gospodarza wtórnego, jakim są łuskowce (pangoliny), a następnie został przeniesiony na ludzi. SARS-CoV-2 to wirus RNA z rodziny Coronaviridae, odkryty w mieście Wuhan w Chinach u pacjenta dotkniętego zapaleniem płuc o nieznanej etiologii. Na podstawie szybkiego wzrostu wskaźnika zakażeń oraz wskaźnika reproduktywności wirusa (R₀), Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) ogłosiła pandemię tej choroby. Do 15 kwietnia 2021 r. na całym świecie zgłoszono ponad 140 milionów przypadków osób zakażonych SARS-CoV-2.

W diagnostyce wirusologicznej – w tym i wykrywaniu SARS-CoV-2 – istnieją trzy podstawowe typy testów: molekularne (genetyczne), antygenowe oraz wykrywające specyficzne przeciwciała anty-SARS-CoV-2. Testy molekularne służą do jak najwcześniejszego wykrywania aktualnie występującej infekcji (wykrywają ją najwcześniej od momentu zakażenia), natomiast te oparte na wykrywaniu antygenów i przeciwciał dają miarodajne wyniki później, ze względu na występowanie tzw. okna serologicznego. W przypadku COVID-19 okres ten wynosi co najmniej 10–14 dni (ryc. 5.1). Z tego też powodu WHO i FDA oraz ECDC rekomendują przede wszystkim testy oparte na metodach biologii molekularnej do diagnostyki ostrych zakażeń SARS-CoV-2. Testy antygenowe mogą stanowić jedynie ich uzupełnienie jako metoda przesiewowa (ryc. 5.2), ułatwiając jednocześnie podjęcie właściwych decyzji klinicznych.

Rycina 5.1

Wykonywanie poszczególnych typów testów w diagnostyce SARS-CoV-2.

Rycina 5.2

Schemat postępowania po wykryciu koronawirusa SARS-CoV-2.

5.1.1. Metody diagnostyki molekularnej SARS-CoV-2

W ciągu kilku tygodni od ogłoszenia pandemii COVID-19 opracowano i wdrożono testy do diagnostyki in vitro (IVD), służące wykrywaniu materiału genetycznego SARS-CoV-2, oparte na technikach biologii molekularnej. Pierwszy test reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym, połączony z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) do wykrywania RNA nowego koronawirusa został opracowany w Niemczech jeszcze na początku stycznia 2020 r. Bazował on na wykrywaniu specyficznych sekwencji genu kodującego białko osłonki β-koronawirusów (gen E) i genu RNA-zależnej RNA polimerazy (RdRp) nowego koronawirusa. Do diagnostyki stosowane są także startery i sonda wykrywające trzy regiony genów białka nukleokapsydu (gen N) SARS-CoV-2, które wykorzystują specyficzną sondę i startery dla trzech genów N (gen N1, N2, N3) z dodatkowymi starterami i sondą do wykrywania ludzkiego genu RNazy P, jako elementem kontroli wewnętrznej. Jak wynika z aktualnego stanowiska WHO, na obszarach, gdzie dochodzi do zakażeń populacyjnych COVID-19, wykrycie pojedynczego genu wirusa wystarcza do potwierdzenia zakażenia SARS-CoV-2. Podobnie i w Polsce, zgodnie z obowiązującą definicją przypadku infekcji COVID-19 z 31 października 2020 r., wykrycie pojedynczego genu wirusa pozwala na laboratoryjne potwierdzenie przypadku zakażenia. Jednak ze względu na ryzyko wyników fałszywie ujemnych, związanych z pojawieniem się nowych wariantów genetycznych wirusa, WHO rekomenduje stosowanie testów diagnostycznych wykrywających 2 lub więcej fragmentów genomu nowego koronawirusa. Z tego też względu w Polsce zaleca się stosowanie testów co najmniej 2-genowych, a optymalnie wykrywających 3 lub więcej obszarów genomu SARS-CoV-2.

Do jakościowego wykrywania określonej specyficznej sekwencji materiału genetycznego SARS-CoV-2, próbka kliniczna jest zwykle uzyskiwana w formie wymazów z nosogardła lub z gardła i nosa pobieranych jednocześnie. U pacjentów z kaszlem i odkrztuszaniem dobrym materiałem diagnostycznym może być także plwocina lub próbki śliny (tab. 5.1). Nie zaleca się jednak indukcji plwociny ze względu na narażenie personelu medycznego na powstające zakaźne bioaerozole. Należy jednak zawsze stosować materiał zalecany i zatwierdzony przez producenta dla konkretnego testu diagnostycznego. Niestety istnieje pewne ryzyko wyników fałszywie ujemnych, związanych z niewłaściwym pobraniem materiału klinicznego do badania, niewłaściwym przechowywaniem i transportem próbki czy obecnością inhibitorów reakcji PCR w pobranych próbkach. Prawdopodobieństwo wyników fałszywie ujemnych dodatkowo rośnie, gdy stosowane odczynniki laboratoryjne są zanieczyszczone lub upłynęła ich data ważności.

Tabela 5.1. Czułość testów molekularnych w zależności od rodzaju badanego materiału biologicznego

---------------------------------------------- ---------
Rodzaj materiału klinicznego Czułość
Wymaz z gardła i nosa pobierany równocześnie 97,0%
Wymaz z nosogardła 92,2%
Ślina pobrana z gardła 90,1%
Plwocina 87,5%
Wymaz z gardła 84,0%
Ślina 83,9%
Wymaz z nosa 82,0%
Kał 46,0%
Łzy / wymaz z worka spojówkowego 17,4%
Krew 7,3%
Mocz 0,0%
---------------------------------------------- ---------

Obecnie zdecydowana większość dostępnych na rynku testów do szybkiej diagnostyki molekularnej zakażeń COVID-19 opiera się na metodzie RT-qPCR. W tym celu wirusowy RNA jest wstępnie ekstrahowany z próbki klinicznej, a następnie oczyszczany. Taka matryca RNA jest przepisywana na komplementarny DNA (cDNA) na drodze odwrotnej transkrypcji, który to jest dalej amplifikowany przez standardową reakcję PCR. Dostępne na rynku testy RT-qPCR funkcjonują w wariancie jednoetapowym (one-step) lub dwuetapowym (two-step). Jednoetapowy RT-qPCR odbywa się w jednej probówce, gdzie zachodzi zarówno odwrotna transkrypcja (RT), jak i później namnożenie matrycy za pomocą techniki PCR. W wariancie dwuetapowym RT-qPCR odwrotną transkrypcję i amplifikację kwasu nukleinowego przeprowadza się oddzielnie z niezależnie zoptymalizowanymi buforami reakcyjnymi. Z jednej strony testy one-step RT-qPCR są preferowane ze względu na swą szybkość i powtarzalność odpowiednią dla masowej diagnostyki COVID-19, ponieważ wymagają one ograniczonych ingerencji w próbki, co znacznie zmniejsza ryzyko kontaminacji oraz błędów ludzkich. Z drugiej strony metody two-step RT-qPCR są zasadniczo bardziej elastyczne i można je dopasować do indywidualnych warunków sprzętowych oraz oferują nieco lepszą czułość i niższą granicę wykrywalności.

Alternatywną metodą jest użycie techniki amplifikacji izotermicznej, połączonej z odwrotną transkrypcją (RT-LAMP), gdzie wykrywane są gen białka kolca (gen S) i gen ORF1a/b SARS-CoV-2, z użyciem 4 różnych starterów. Należy pamiętać, że użycie techniki RT-LAMP umożliwia otrzymanie wyniku w ciągu kilkudziesięciu minut, co byłoby bardzo przydatne w kwalifikowaniu pacjentów przy przyjęciu do szpitali. Badania wykonywane przy wykorzystaniu metod opartych na RT-qPCR trwają nieco dłużej, ale za to cechują się większą niezawodnością i specyficznością w porównaniu z techniką opisaną wyżej. Standardowy test RT-qPCR trwa średnio od 90 do 120 minut, natomiast badanie z użyciem technologii RT-LAMP można wykonać już w ciągu 15–30 minut. Ze względu na możliwość wykonywania większej liczby jednorazowych oznaczeń mogą być więc przydatne do badań epidemiologicznych na dużych grupach hospitalizowanych pacjentów lub osób poddanych badaniom przesiewowym. Do wizualizacji wyników w metodzie RT-LAMP stosuje się często techniki kolorymetryczne, które umożliwiają odczyt wyników amplifikacji wirusowego RNA gołym okiem, bez konieczności stosowania drogiego sprzętu laboratoryjnego.

Szybkie testy molekularne są szczególnie przydatne na oddziałach ratunkowych i szpitalnych izbach przyjęć (point of care), gdzie są potrzebne, aby przyspieszyć proces podejmowania właściwych decyzji klinicznych oraz potencjalnie zmniejszyć obciążenie pracą scentralizowanych laboratoriów diagnostycznych. W tym celu amerykańska firma Cepheid opracowała szybki test oparty na technice RT-qPCR, którego wykonanie, jak deklaruje producent, zajmuje 45 minut. Test ten, dostosowany do zautomatyzowanej platformy GeneXpert, otrzymał zgodę amerykańskiej FDA i jest już także stosowany w niektórych placówkach w Polsce.

Trzeba pamiętać, że testy RT-qPCR powinny być wykonywane w akredytowanych laboratoriach, które są wpisane na listę laboratoriów COVID Ministerstwa Zdrowia. Szybkie testy genetyczne (RT-qPCR lub RT-LAMP) mogą być stosowane także jako testy przyłóżkowe przez przeszkolony personel, jeżeli producent testu uwzględnił taką możliwość w procedurze rejestracji wyrobu medycznego do diagnostyki in vitro. Nadzór nad jakością tych badań pełni wówczas stosowne laboratorium wpisane na listę laboratoriów COVID Ministerstwa Zdrowia. W przypadku ograniczonej dostępności do badań genetycznych, należy priorytetowo traktować próbki pobrane od pacjentów z niewydolnością oddechową lub istotnym pogorszeniem stanu klinicznego oraz w stanach nagłych. Nadrzędnie trzeba również traktować diagnostykę szeroko pojętego personelu medycznego, pracującego z chorymi na COVID-19 i pacjentami mogącymi być nosicielami wirusa oraz manifestującego objawy zakażenia SARS-CoV-2.