Krótkie wykłady. Mikrobiologia - ebook

WSTĘP

Czwarte wydanie Krótkich wykładów z mikrobiologii bazuje na zmianach wprowadzonych w edycji trzeciej; niniejszy podręcznik lepiej wpasowuje się też w całą serię. Zdecydowaliśmy, że pominiemy w nim fragmenty dotyczące procesów biochemicznych składających się na główne szlaki metaboliczne i ogólny metabolizm DNA (więcej informacji na ten temat czytelnik znajdzie w innych książkach z serii Krótkie wykłady). W zamian rozszerzone zostały wykłady na temat procesów biochemicznych u bakterii i archeonów, przy czym jednocześnie zależało nam na uniknięciu szczegółowego omówienia technik molekularnych nowej generacji. Mimo że sekwencjonowanie wysokoprzepustowe, mikromacierze i inne techniki związane z kwasami nukleinowymi wywierają ogromny wpływ na mikrobiologię, metody te są lepiej opisane w innych książkach. Usunęliśmy także fragmenty poświęcone infekcjom bakteryjnym, ponieważ również w tym przypadku są one szczegółowo omawiane w innych tekstach z serii Krótkie wykłady. Niemniej we wszystkich rozdziałach w dalszym ciągu nawiązujemy do procesów chorobotwórczych u człowieka, ponieważ nie da się całkowicie zerwać związków między mikrobiologią a medycyną. W szczególności odnosi się to do rozdziału poświęconego wirusologii, który został uzupełniony w taki sposób, by odzwierciedlić zmiany, jakie nastąpiły w tym obszarze w zakresie terminologii i praktyk badawczych.

Tak jak poprzednio, słowa „bakterie” używamy na opisanie organizmów z domeny Bacteria, a nie – tak jak czyniono to wcześniej – mikroorganizmów nieeukariotycznych. W odniesieniu do tej ostatniej grupy posługujemy się terminem „prokarioty”, obejmującym zarówno bakterie (Bacteria), jak i archeony (Archaea). Poczynione w wydaniu trzecim przewidywania, że do czasu kolejnej edycji książki taksonomia mikroorganizmów zostanie poddana rewizji, okazały się, jeśli chodzi o prokarioty, nieprawidłowe, ale w odniesieniu do eukariotów musieliśmy już wprowadzić znaczące zmiany w poświęconych im rozdziałach, tak by odzwierciedlić współczesne podejście taksonomiczne. Zrewidowaliśmy również taksonomię grzybów, zgodnie z postępami uczynionymi w badaniach nad nimi. Można z dużym prawdopodobieństwem przyjąć, że przez następnych kilka lat ta grupa organizmów nadal będzie cieszyć się zainteresowaniem naukowców.

Autorzy pragną podziękować pracownikom Wydziału Nauk Biologicznych i Medycznych na Oxford Brooks University oraz Wydziału Nauk Biologicznych w Birkbeck College za pomoc w przygotowywaniu tej książki. Jesteśmy niezmiennie wdzięczni także naszym przyjaciołom i rodzinom za ich nieustające wsparcie, jak również wszystkim, którzy podpowiedzieli nam, w jaki sposób możemy ulepszyć poprzednie wydanie tekstu.A1.
Świat drobnoustrojów

Podstawowe pojęcia

Mikroorganizmy przynależą do wszystkich trzech głównych domen organizmów żywych: Bacteria, Archaea i Eukarya. O przynależności danego organizmu do eukariotów decyduje posiadanie jądra. Bakterie, jak i archeony, są prokariotami. Oprócz posiadania jądra różnice między eukariotami a prokariotami dotyczą wielu ich cech fizjologicznych i biochemicznych.

Co to są mikroorganizmy?

Mikroorganizmy to różnorodna grupa organizmów, na którą składają się wirusy, organizmy jednokomórkowe (archeony, bakterie, protisty, niektóre grzyby i niektóre zielenice) oraz niewielka liczba organizmów cechujących się strukturą wielokomórkową (większe grzyby i zielenice). Mikroorganizmy o większych rozmiarach charakteryzują się posiadaniem włóknistej plechy lub tworzą struktury parenchymatyczne, niewykazującej jednak rzeczywistego zróżnicowania na poszczególne tkanki. Większości mikroorganizmów nie jesteśmy w stanie dostrzec bez użycia mikroskopu.

Mikrobiologia

Mikrobiologia to nauka o mikroorganizmach. Dziedzina ta obejmuje współcześnie zarówno badania nad biologią molekularną mikroorganizmów, ich ekologią funkcjonalną, jak również nad ich strukturą i fizjologią. Narodziny tej dyscypliny datuje się na wiek XVII, kiedy to za pomocą prostego mikroskopu Leeuwenhoek odkrył istnienie bakterii. W latach 50. i 60. XIX wieku Louis Pasteur w drodze prostych eksperymentów, wykorzystując sterylny bulion wołowy, ostatecznie obalił akceptowaną przez długi czas teorię samorództwa, tłumaczącą powstawanie mikroorganizmów; w ten właśnie sposób mikrobiologia stała się nauką głównego nurtu.

Na początku mikrobiologia sprowadzała się do badania środowisk w rodzaju gleby lub osadu i analiz naturalnych procesów fermentacji oraz infekcji; dopiero gdy pod koniec XIX wieku Robert Koch opracował technikę izolowania czystych kultur bakterii, nauka ta przeszła do etapu redukcjonistycznego, w którym mikroorganizmy mogły być izolowane i charakteryzowane w laboratoriach.

W XX wieku mikrobiologowie odkryli i opisali wiele nowych mikroorganizmów, w tym nową domenę mikroorganizmów (Archaea), nowe patogeny bakteryjne, takie jak Legionella i MRSA (ang. methicillin-resistant Staphylococcus aureus – oporny na metycylinę Staphylococcus aureus, czyli gronkowiec złocisty), i grupę patogenów związanych z HIV (wirusem nabytego niedoboru odporności), do której należy także grzyb Pneumocystis. Odkrycie unikatowych zespołów mikroorganizmów bytujących w warunkach skrajnych i cechujących się występowaniem termostabilnych polimeraz DNA (kwasu deoksyrybonukleinowego) utorowało drogę do nowych osiągnięć w dziedzinie biologii molekularnej.

Gwałtowny postęp, jaki dokonał się w zakresie technik wykorzystywanych w biologii molekularnej, umożliwił powrót mikrobiologii do badania środowisk naturalnych. Techniki w rodzaju DGGE (ang. denaturing gradient gel electrophoresis – elektroforeza w gradiencie żelu denaturującego), SCCP (ang. single-stranded conformation polymorphism) – polimorfizm konformacji fragmentów jednoniciowych), mikromacierze DNA i hybrydyzacja in situ to narzędzia, dzięki którym możemy analizować ekologię zespołów mikroorganizmów na poziomie molekularnym. Oto jak mikrobiologia wróciła do swych korzeni!

Bakterie, archeony i eukarioty

Na świat mikroorganizmów składają się trzy główne linie, z których wszystkie – jak się sądzi – wyewoluowały od jednego wspólnego przodka (ryc. 1). Linie te formalnie nazywamy domenami; wyodrębniono je na podstawie sekwencji genów wspólnych wszystkim organizmom (rozdział B3). Omawiane domeny to bakterie (wcześniej nazywane eubakteriami), archeony (wcześniej nazywane archebakteriami) i eukarioty. Cechą odróżniającą eukarioty od archeonów i bakterii jest posiadanie przez te pierwsze jądra. Wygodnie jest klasyfikować linie pozbawione jądra (tj. bakterie i archeony) jako prokarioty. Wszystkie prokarioty to mikroorganizmy, podczas gdy do eukariotów zaliczamy nie tylko mikroskopijne grzyby, zielenice i protisty (rozdziały H i I), ale również makroorganizmy, takie jak rośliny wyższe i zwierzęta.

Struktura komórki prokariotycznej charakteryzuje się nieobecnością jądra, jak również organelli dostarczających energię, takich jak mitochondria i chloroplasty. Prokarioty uzyskują bowiem energię w drodze fosforylacji substratowej i fosforylacji oksydacyjnej (zachodzącej w błonach komórkowych; rozdział E). Oprócz tych kluczowych różnic prokarioty od eukariotów różni szereg własności biochemicznych i fizjologicznych, z których najważniejsze przedstawia tab. 1. Różnice między bakteriami i archeonami (rozdział C6) omówione zostały w innych książkach.

Ryc. 1. Trzy główne linie, które wyewoluowały od wspólnego przodka

Tab. 1. Najważniejsze różnice między prokariotami a eukariotami

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Prokarioty Eukarioty
Organizacja materiału genetycznego i replikacja
DNA występujący luźno w cytoplazmie DNA zawarty w otoczonej błoną strukturze
Chromosom – najczęściej haploidalny, pojedynczy, kolisty Chromosomy w liczbie większej niż jeden – zazwyczaj diploidalne i liniowe
DNA połączony z białkami histonopodobnymi DNA połączony z histonami
Częścią genomu może być DNA pozachromosomowy Organelle mogą zawierać osobne chromosomy, ale DNA rzadko występuje luźno w cytoplazmie
Podział poprzeczny komórki lub pączkowanie Mitotyczny podział komórki
Transfer informacji genetycznej może nastąpić drogą koniugacji, transdukcji i transformacji Transfer informacji genetycznej może nastąpić tylko w toku rozmnażania płciowego
Organizacja komórki
Błona cytoplazmatyczna wzmocniona hopanoidami (z wyjątkiem archeonów) Błona cytoplazmatyczna wzmocniona sterolami
Ściana komórkowa zbudowana z peptydoglikanu i lipopolisacharydów lub kwasów tejchojowych. U archeonów zróżnicowana budowa ścian komórkowych Często brak sztywnej ściany komórkowej, ale komórkę wzmacnia cytoszkielet zbudowany z mikrotubul. Ściana komórkowa, jeśli występuje, zbudowana jest z cienkiej warstwy chityny lub celulozy
Uzyskiwanie energii związane z błoną komórkową Uzyskiwanie energii związane z błonami mitochondriów i chloroplastów
Błony wewnętrzne uczestniczące w wyspecjalizowanych szlakach biochemicznych (np. utleniania amoniaku, fotosyntezie) Błony wewnętrzne występujące w większości komórek (retikulum endoplazmatyczne, aparat Golgiego itp.)
Rzęski zbudowane z jednego białka – flageliny Wielobiałkowe rzęski, z układem włókienek 9+2
Małe rybosomy (70S) Większe rybosomy (80S)
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Tematy omawiane w podręczniku

W obecnym wydaniu zrezygnowaliśmy z omawiania patogenności bakterii, skupiając się w zamian na ich systematyce, fizjologii i biochemii. Z uwagi na ich znaczenie dla ludzkości patogeny bakteryjne należą do najlepiej zbadanych drobnoustrojów; szczegółową wiedzę na temat wywoływanych przez nie chorób prezentuje książka Krótkie wykłady. Mikrobiologia medyczna.

Systematyka

Systematyka bakterii pozwala naukowcom nazywać, klasyfikować i identyfikować bakterie i archeony w logiczny sposób. Znaczenie biologii molekularnej dla badań mikrobiologicznych ilustruje pierwszorzędna rola, jaką w filogenetyce drobnoustrojów odgrywa sekwencjonowanie 16S rRNA (rybosomowego kwasu rybonukleinowego).

Mikrobiologia ogólna

Historia mikrobiologii jako nauki jest długa i skomplikowana, a przy tym należy mieć na uwadze, że dopiero zaczynamy w pełni pojmować różnorodność ekologiczną, biochemiczną i genetyczną drobnoustrojów. Do analizy wzrostu drobnoustrojów w warunkach laboratoryjnych służy wiele wyrafinowanych technik. Nasza wiedza na temat mikroorganizmów poszerzyła się, możemy więc teraz w pełni opisać strukturę komórki prokariotycznej. Poznanie mechanizmów podziału komórek mikroorganizmów i sposobów ich poruszania się doprowadziło ponadto do ważnych przełomów w biologii eukariotów. Dysponujemy rozległą wiedzą na temat mikrobiologicznych podstaw chorób człowieka, natomiast dopiero teraz zaczynamy rozumieć, jak istotną rolę drobnoustroje pełnią w obiegu biogeochemicznym pierwiastków.

Wzrost drobnoustrojów

Sposób wzrostu prokariotów w hodowlach okresowych i ciągłych może być przedmiotem modelowania matematycznego, dzięki któremu odkrywamy ograniczenia wynikające z warunków laboratoryjnych. Modele te wskazują, że przy projektowaniu jakiegokolwiek sprzętu używanego do hodowania w pierwszym rzędzie należy mieć na uwadze optymalizację wymagań tlenowych bakterii.

Biologia molekularna

Mikrobiologia zawsze była nierozerwalnie związana z postępami w obszarze genetyki, metabolizmu DNA i inżynierii genetycznej in vitro i in vivo w całym obszarze biologii. Zasady rządzące replikacją DNA, transkrypcją, której produktem jest mRNA, i translacją, której produktem jest białko, po raz pierwszy opisano na przykładzie Escherichia coli. Łącząc te rozpoznania z naszą szczegółową wiedzą na temat regulacji transkrypcji i mechanizmów transferu DNA między komórkami, możemy teraz wykorzystywać bakterie jako niezwykle pomocne narzędzia technologii rekombinacji DNA.

Drobnoustroje eukariotyczne

Omówionych zostanie wiele odrębnych grup drobnoustrojów eukariotycznych, wyróżnionych w klasyfikacji strony internetowej Tree of Life. Przedmiotem tej części książki jest także ogólna biologia komórki i proces podziału komórkowego drobnoustrojów eukariotycznych, jak również – w osobnych rozdziałach – budowa, fizjologia i rozmnażanie grzybów oraz fotosyntetycznych i niefotosyntetycznych protistów. Uwagę poświęcono także korzystnym i szkodliwym wpływom każdej z tych grup drobnoustrojów na środowisko, jak i omówiono taksonomię i patogenność protistów pasożytniczych.

Wirusy

Wirusy to niezwykle różnorodna grupa infekcyjnych czynników niekomórkowych, które są aktywne tylko wówczas, gdy pasożytują na komórce żywej (zwierzęcej, roślinnej, bakteryjnej itp.). W celu objaśnienia podstawowych pojęć wirusologicznych, w tym budowy wirusów na poziomie molekularnym, wybraliśmy wirusy istotne z medycznego punktu widzenia. Są one ważne w kontekście taksonomicznym, ale także – jak pokazują dalsze rozdziały – odgrywają znaczącą rolę w opracowywaniu szczepionek profilaktycznych i terapii przeciwwirusowych. Przyglądamy się tu fazom cyklu replikacji (namnażania) wirusa, omawiając także najważniejsze ich warianty, i opisujemy skutki kliniczne infekcji dla całego organizmu. Zamieściliśmy w tej części także krótkie wprowadzenie do zagadnienia mniej zbadanych czynników infekcyjnych – wiroidów, występujących u roślin, i prionów, wywołujących u ssaków choroby neurologiczne.B1.
Systematyka prokariotów

Podstawowe pojęcia

Klasyfikacja i taksonomia

Klasyfikacja to metoda porządkowania informacji. Mikroorganizmy można klasyfikować na podstawie ich zdolności do wzrostu w określonych warunkach (np. chemolitotrofy, denitryfikatory), jednak oficjalna klasyfikacja opiera się na systematyce Linneusza. Pełna klasyfikacja danego drobnoustroju to jego taksonomia. Drobnoustroje można identyfikować na podstawie ich nazwy rodzajowej i gatunkowej.

Identyfikacja prokariotów

Identyfikacja polega na przyporządkowywaniu nowych izolatów do istniejących już ram taksonomicznych, zazwyczaj do poziomu rodzaju i gatunku. Należy jednak mieć na uwadze, że w przypadku prokariotów definicja gatunku jest wciąż mniej jasna niż w przypadku wyższych eukariotów.

Filogeneza prokariotów

Zależności ewolucyjne drobnoustroju w obrębie taksonu i między taksonami to jego filogeneza. Wykorzystywanie sekwencji DNA do opisywania tych zależności doprowadziło do wyłonienia się filogenetyki. Taksonomia bakterii i archeonów w przeważającym stopniu odzwierciedla ich filogenezę.

ZAGADNIENIA POWIĄZANE

B2. Identyfikacja bakterii

B3. Analizy filogenetyczne na podstawie sekwencji genu rRNA

C2. Różnorodność prokariotów

C11. Prokarioty i ich środowisko

Klasyfikacja i taksonomia

Wraz z pojawieniem się metod molekularnych granice między identyfikacją, klasyfikacją a zależnościami ewolucyjnymi się zatarły. W bakteriologii klasyfikacja to po prostu metoda porządkowania informacji. U podłoża tego porządkowania może, ale nie musi, leżeć jakiś sens. Możemy stwierdzić, że będziemy klasyfikować bakterie na podstawie koloru ich kolonii hodowanych na płytkach agarowych, w związku z czym wyróżnionych zostanie niewiele bakterii żółtych i czerwonych, podczas gdy ich większość zostanie zaliczona do grupy białej i kremowej. Na wczesnym etapie rozwoju mikrobiologii organizmy klasyfikowano na podstawie ich kształtu; najliczniejszą grupę tworzyły wówczas bakterie o kształcie pałeczki (niektóre z nich zwane są laseczkami), a mniej liczne były ziarniaki, bakterie nitkowate itp. Warto podkreślić, że klasyfikacje te były arbitralne, choć nadal są w użyciu. Mikrobiologowie klasyfikują też organizmy na podstawie ich zdolności do wzrostu w określonych warunkach wzrostu (beztlenowce, chemolitotrofy, metylotrofy itp.; rozdziały C2 i D1).

Podstawowym narzędziem klasyfikacji wykorzystywanym w mikrobiologii, jak i w pozostałych obszarach biologii, jest systematyka Linneusza. Jest to system hierarchiczny, w ramach którego grupy wyższego rzędu dzielą się hierarchicznie na grupy niższe, aż do poziomu gatunku (ryc. 1).

Ryc. 1. Pełna systematyka Linneusza

Oto pełna klasyfikacja Escherichia coli: Bacteria (domena), Proteobacteria (typ), Gammaproteobacteria (klasa), Enterobacteriales (rząd), Enterobacteriaceae (rodzina), Escherichia (rodzaj) i coli (gatunek). Każdy z tych poziomów nazywamy taksonem. Omawiana systematyka pozwala biologom na precyzyjną identyfikację organizmu we wszystkich domenach i królestwach wyłącznie na podstawie jego rodzaju i gatunku. Pełna nazwa E. coli to jest jej taksonomia, zaś system Linneusza to klasyfikacja taksonomiczna.

W tym tekście do opisywania bakterii i archeonów (prokarioty) stosuje się prawidłowe nazwy domen i królestw. W nieco starszych modelach klasyfikacyjnych domeny nosiły nazwy Eubacteria (bakterie właściwe) i Archaebacteria, które pod pewnymi względami były bardziej obrazowe.

Identyfikacja prokariotów

Dysponując metodą taksonomii prokariotów i używając jej do opisu i identyfikowania gatunków, mikrobiolog może umieścić dany organizm w tych ramach klasyfikacyjnych. Po uzyskaniu czystej kultury organizm nazywany jest izolatem, któremu nadaje się numer ułatwiający jego odróżnienie od innych organizmów w laboratorium. Izolaty mogą być identyczne genetycznie, mimo że zostały pobrane ze środowiska naturalnego w różnym czasie i miejscu.

Z reguły przyporządkowanie nowej bakterii do odpowiedniego rodzaju nie budzi zastrzeżeń, wobec czego omawiany izolat może zostać nazwany, dajmy na to, szczepem Parococcus NCIMB 844. W odniesieniu do bakterii i archeonów, z uwagi na ich ogromną różnorodność genetyczną, pojęcie gatunku nastręcza większych trudności niż w przypadku królestwa zwierząt. Do opisania organizmów tego samego gatunku o różniących się nieco własnościach stosuje się pojęcie biowaru; na biowary Orientalis i Mediaevalis dzieli się na przykład wywołującą dżumę bakterię Yersinia pestis. Różniące się szczepy tego samego gatunku dzieli się czasem na podgatunki, na przykład patogen roślin Pectobacterium carotovorum zawiera dwa podgatunki: atroseptica i carotovorum. W tym przypadku podgatunek obejmuje przedstawicieli gatunku wywołujących określone choroby roślin. W badaniach mikrobiologicznych kłopot z definicją gatunku sprawia, że przy opisywaniu danego organizmu najlepiej jest zachować pierwotny kod izolatu, dzięki czemu możliwe będzie odtworzenie jego historii w różnych laboratoriach.

Choć wśród mikrobiologów panuje zgoda co do klasyfikowania poszczególnych bakterii i archeonów do poziomu rodzaju, wciąż na rozstrzygnięcie czeka kwestia definicji podstawowej jednostki różnorodności genetycznej, mianowicie gatunku. Definicja gatunku należącego do określonego rodzaju (np. na podstawie homologii DNA w procencie nie mniejszym od wyznaczonego progu) niekoniecznie sprawdza się w odniesieniu do gatunku należącego od innego rodzaju, co stanowi szczególny problem w przypadku taksonów zdominowanych przez patogeny człowieka (rozdział B2). Jeśli zaś nie jesteśmy w stanie w prawidłowy i spójny sposób zdefiniować gatunku, problematyczna staje się procedura identyfikacji organizmu do tego właśnie poziomu. Metody identyfikacji prokariotów, czyli sposoby klasyfikowania nowych izolatów, omawiane są szerzej w rozdziale B2.

Filogeneza prokariotów

Filogeneza to opis zależności ewolucyjnych w obrębie taksonów i między nimi. Badania mikrobiologiczne (inaczej niż przypadku badań nad roślinami czy zwierzętami) zamiast na morfologii opierają się w ogromnym stopniu na sekwencjach DNA stanowiących źródło danych filogenetycznych; nauka ta to filogenetyka. Klasyfikacja bakterii i archeonów w przeważającym stopniu odzwierciedla ich filogenezę, a przynajmniej naszą obecną wiedzę filogenetyczną. Zawsze istnieje oczywiście przestrzeń do debat nad danym systemem klasyfikacji; uczeni wciąż dyskutują na temat prawidłowości statusu filogenetycznego i taksonomicznego wielu gatunków i rodzajów.B2.
Identyfikacja bakterii

Podstawowe pojęcia

Identyfikacja bakterii

Do niedawna w warunkach laboratoryjnych izolat identyfikowano na podstawie przeprowadzanych przez niego procesów biochemicznych. Obecnie coraz częściej pierwszym kryterium wykorzystywanym przy opisywaniu nowego izolatu są dane uzyskane w wyniku sekwencjonowania, a cechy fizjologiczne i biochemiczne bierze się pod uwagę jako dodatkowe potwierdzenie klasyfikacji lub nie bierze się ich pod uwagę w ogóle.

Identyfikacja na podstawie charakterystyki wzrostu

W identyfikacji izolatów można brać pod uwagę ich wzrost na określonych podłożach, które mogą być selektywne i różnicujące (diagnostyczne). Określając zdolność danego organizmu do rozkładu konkretnych cukrów i biorąc pod uwagę, jakimi enzymami organizm ten dysponuje, opracowuje się taksonomię numeryczną. Następnie można ją wykorzystać do identyfikacji organizmu, czy to korzystając z dostępnych baz danych, czy to z Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria.

Inne metody identyfikacji

Mikroorganizmy można identyfikować na podstawie wytwarzanych przez nie, w określonych warunkach, kwasów tłuszczowych (FAME, analiza metylowanych estrów kwasów tłuszczowych) lub analizując sekwencję ich 16S rRNA.

Identyfikacja patogenów

W laboratoriach medycznych częściej stosuje się klasyfikację biochemiczną wyizolowanej czystej kultury niż techniki molekularne, które wykorzystywane są raczej w badaniach nieklinicznych. Ponieważ jednak metoda PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) staje się tańsza, coraz więcej laboratoriów medycznych wdraża techniki molekularne. Identyfikacja bakterii patogennych opiera się bardziej na ich właściwościach chorobotwórczych niż na ich filogenezie, co prowadzi do pewnych nieprawidłowości w klasyfikacji bakterii.

ZAGADNIENIA POWIĄZANE

B1. Systematyka prokariotów

B3. Analizy filogenetyczne na podstawie sekwencji genu rRNA

Identyfikacja bakterii

Choć do identyfikacji i klasyfikacji bakterii coraz powszechniej stosuje się metody molekularne (rozdział B3), większość badań identyfikacyjnych prowadzonych w laboratoriach na całym świecie wciąż opiera się na tańszych metodach biochemicznych i metodach badających wzrost hodowli. Co więcej, pełna identyfikacja każdej bakterii spełniająca standardy publikacyjne musi być wieloetapowa, tj. obejmować molekularną, biochemiczną i odnoszącą się do wzrostu charakterystykę danego szczepu. Jeśli bakterię można wyhodować z próbki klinicznej lub środowiskowej, pierwszym etapem procesu jej identyfikacji i klasyfikacji są badania nad jej wzrostem, po których następuje analiza enzymów wykrywanych w danym szczepie i – wreszcie – molekularna analiza genomu.

Identyfikacja na podstawie charakterystyki wzrostu

Niezidentyfikowany izolat bakteryjny może być pasażowany na różnych rodzajach podłoży stałych i płynnych w celu usprawnienia jego identyfikacji. Ogólnie rzecz biorąc, podłoża dzielą się na dwa typy: podłoża selektywne umożliwiają wzrost jednego rodzaju bakterii przy jednoczesnym zahamowaniu wzrostu innych bakterii oraz podłoża różnicujące, zwane też podłożami diagnostycznymi, zawierające z reguły jakiś wskaźnik, którego zmiana (np. koloru) powiązana jest z pewną unikatową właściwością biochemiczną danej grupy drobnoustrojów (rozdział C3). Jeśli uda się uzyskać czystą kulturę szczepu, można przeprowadzić barwienie Grama i analizę morfologiczną. Po uzyskaniu pełnego obrazu wzrostu organizmu przeprowadza się szczegółową analizę zdolności wykorzystywania przez ten organizm cukrów (i sprawdza się, czy w trakcie ich rozkładu produkowany jest kwas), a także stwierdza się występowanie określonych enzymów. Właściwości podsumowuje się i określa ich wartość punktową, zestawiając ją ze znanymi właściwościami innych organizmów, czego wynikiem jest podstawowa taksonomia numeryczna. Można nabyć odpłatne zestawy półautomatyzujące cały proces, ale ograniczają się one tylko do wybranych grup prokariotów, w szczególności do bakterii jelitowych. W przypadku większości izolowanych ze środowiska niepatogennych bakterii i archeonów wskazówek należy szukać w poświęconym identyfikacji prokariotów Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria.

Inne metody identyfikacji

Jeśli dany organizm może być hodowany w tych samych warunkach co wiele innych szczepów referencyjnych, mikrobiolog dysponuje dodatkowymi metodami identyfikacji. Lipidy czystej kultury mogą zostać poddane ekstrakcji, estryfikacji, a następnie badaniu za pomocą (chromatografii gazowej . Metoda FAME wymaga porównania komputerowego uzyskanych wyników ze składem lipidowym innych organizmów hodowanych dokładnie w ten sam sposób na dokładnie takim samym podłożu. Jest to procedura szybka i niedroga, jednak skomplikowany może być proces interpretacji i może nie dać się go przeprowadzić w odniesieniu do organizmów rozwijających się w nietypowych warunkach. Profil FAME każdego organizmu zmienia się w zależności od wykorzystywanego podłoża hodowlanego. Wariantem omawianej metody jest analiza fosfolipidowych kwasów tłuszczowych (PLFA, ang. phospholipid linked fatty acid analysis) o charakterze bardziej specyficznym i cechująca się większą czułością.

Jako że łatwiejsze i tańsze staje się sekwencjonowanie DNA, obecnie standardową metodą uzupełniającą wyniki analiz biochemicznych i fizjologicznych jest sekwencjonowanie genu 16S rRNA (rozdział B3). Choć podejście to jeszcze bardziej rozmywa granice między identyfikacją a filogenezą, wyniki można pozyskać łatwo i niskim kosztem; uwzględnianie wyłącznie danych sekwencyjnych może jednak wprowadzać badacza w błąd.

Identyfikacja patogenów

Do pewnego stopnia, a konkretnie jeśli idzie o identyfikację organizmów chorobotwórczych, mikrobiologia medyczna znajduje się w ogonie mikrobiologii jako nauki. Z uwagi na koszty wciąż przeprowadza się tu rutynową identyfikację patogenów na podstawie klasycznych metod bakteriologicznych. Sprowadza się to zazwyczaj do: izolacji lub wzbogacenia bakterii z preparatu klinicznego za pomocą bulionu lub agaru, przygotowania czystej kultury z hodowli pierwotnej uzyskanej, identyfikacji bakterii pod mikroskopem, opisania charakterystyki jej wzrostu i czasem także przeprowadzenia PCR. Z uwagi na to, że metoda ta bazuje na hodowli patogenów, wiele z nich umykało uwadze naukowców. Dla przykładu przez lata nie wiedziano, że najczęstszym patogenem wywołującym zatrucie pokarmowe są bakterie z rodzaju Campylobacter, ponieważ były kłopoty z ich hodowaniem w laboratorium. Niektóre bakterie są żywe, lecz niedające się hodować (VNBC, ang. viable but non-culturable), co oznacza, że można jest wykryć, ale nie można wyhodować ich w laboratorium). W mikrobiologii środowiskowej ten termin funkcjonuje już od dawna. Jeśli mikrobiologia medyczna przyjmie do wiadomości ich istnienie, to wzrośnie poprawność diagnoz, jako że koszty PCR stopniowo spadają.

Identyfikacja i nazewnictwo patogenów opiera się raczej na objawach zgłaszanych przez pacjenta aniżeli na ogólnych właściwościach samego mikroorganizmu. Dla przykładu rodzaje bakterii jelitowych są bardzo blisko spokrewnione na poziomie genetycznym, ale wywołują wiele różnych chorób u człowieka (tab. 1). Dzięki analizom prowadzonym na poziomie molekularnym istnieje obecnie coraz większa jasność co do tego, że patogenne gatunki rodzaju Bacillus, bakterii Gram-dodatnich, mogą stanowić w istocie jeden, ten sam gatunek i różnią się tylko zestawami plazmidów.

Tab. 1. Choroby wywoływane przez bakterie jelitowe zaliczane do różnych rodzajów

------------- ----------------------------------------------
Rodzaj Choroba
Escherichia Biegunka wywołana przez pałeczkę okrężnicy
Shigella Czerwonka
Salmonella Dur brzuszny, zakażenie przewodu pokarmowego
Vibrio Cholera, zakażenie przewodu pokarmowego
Klebsiella Zapalenie płuc
Yersinia Dżuma
------------- ----------------------------------------------

Tab. 2. Choroby wywoływane przez blisko spokrewnione gatunki rodzaju Bacillus

------------------ --------------------------------
Gatunek Choroba
B. subtilis Gatunek niepatogenny
B. anthracis Wąglik
B. cereus Zakażenie przewodu pokarmowego
B. thuringiensis Patogen zakażający owady
------------------ --------------------------------B3.
Analizy filogenetyczne na podstawie sekwencji genu rRNA

Podstawowe pojęcia

Filogeneza bakterii

Dzięki pojawieniu się molekularnych metod filogenetycznych w laboratoriach mikrobiologicznych można prowadzić więcej analiz filogenetycznych.

Pojęcie zegara molekularnego

Zmiany w DNA lub sekwencji aminokwasowej białek, zachodzące w długim okresie, mogą być wskaźnikiem ogólnych zmian ewolucyjnych, jakie zaszły od momentu pojawienia się wspólnego przodka. Wybrany zegar ewolucyjny powinien występować uniwersalnie, wykazywać homologię funkcjonalną i cechować się konserwowaną sekwencją. Aby móc odróżniać okresy zmian gwałtownych od okresów zmian powolnych, wybrana cząsteczka powinna zawierać zarówno regiony o wysokim stopniu konserwacji, jak i regiony o bardzo wysokiej zmienności.

RNA rybosomowy (rRNA)

Sugeruje się, że odpowiednim zegarem może być cytochrom c, jednak to sekwencja 16S rRNA zyskała szeroką akceptację społeczności badaczy. Długość sekwencji nukleotydowej tej cząsteczki nadaje się do stosowania w większości protokołów sekwencjonowania, pozostawia ona jednak wątpliwości co do prawidłowości pewnych analiz filogenetycznych. Ribosomal Database Project zawiera już ok 1,4 mln sekwencji bakteryjnego rRNA.

Otrzymywanie sekwencji genu 16S rRNA

Do amplifikacji genów 16S rRNA pochodzących od różnych organizmów wykorzystuje się zestawy starterów uniwersalnych, przy czym obecnie nie istnieje taki zestaw starterów, dzięki któremu możliwa byłaby amplifikacja wszystkich znanych nauce gatunków. W populacjach mieszanych zestawy starterów mogą czasem generować fałszywe wyniki z powodu powstawania chimerycznych produktów PCR z więcej niż jednej matrycy.

Analizy bioinformatyczne genu 16S rRNA

Po amplifikacji i zsekwencjonowaniu produktu PCR 16S rRNA należy ustalić jego zależności filogenetyczne z innymi sekwencjami. Na początku otrzymana sekwencja musi zostać przyrównana do innych podobnych sekwencji. Do opracowywania drzew filogenetycznych służą następujące metody: łączenie sąsiadów i maksymalna parsymonia, metoda największej wiarygodności i metody bayesowskie. Przy ich stosowaniu z jednego zbioru danych wciąż mogą być generowane różne drzewa, dlatego też wykorzystywany jest bootstraping, dzięki któremu uzyskuje się wartość wsparcia dla danej gałęzi.

ZAGADNIENIA POWIĄZANE

B1. Systematyka prokariotów

B2. Identyfikacja bakterii

Filogeneza bakterii

Wzajemne pokrewieństwo bakterii omówione jest w innym miejscu tej książki (rozdział C6), w kontekście ich różnorodności. Większość głównych typów taksonomicznych bakterii (Cyanobacteria, Proteobacteria itp.) ustanowiono na podstawie klasycznych metod taksonomicznych i pozostają one w mocy od dekad. Dzięki pojawieniu się w ostatnim czasie molekularnych metod filogenetycznych w laboratoriach mikrobiologicznych można prowadzić więcej analiz filogenetycznych.

Pojęcie zegara molekularnego

Mikrobiolog powinien móc umieścić jakikolwiek organizm w kontekście jego związków z innymi organizmami i w kontekście ewolucji, począwszy od ich wspólnego przodka. Aby było to możliwe, należy wybrać zegar ewolucyjny, który będzie odzwierciedlał drobne zmiany zachodzące w organizmie na przestrzeni czasu. Potencjał uzyskania statusu zegara ewolucyjnego mają makrocząsteczki komórkowe, takie jak białka i kwasy nukleinowe, aby jednak były zegarem idealnym, muszą spełniać poniższe kryteria:

• Muszą występować powszechnie, tj. u wszystkich znanych nauce organizmów (a przypuszczalnie także u wszystkich organizmów, które dopiero zostaną odkryte).

• Muszą wykazywać homologię funkcjonalną, tj. dana cząsteczka musi mieć tę samą funkcję u wszystkich organizmów. Można zakładać, że cząsteczki pełniące różne funkcje są zbyt różnorodne, by odzwierciedlać jakiekolwiek podobieństwo sekwencji.

• Muszą wykazywać konserwację sekwencji. Idealny zegar powinien mieć zarówno regiony o wysokim stopniu konserwowania sekwencji, które zmieniają się bardzo wolno w długim okresie, jak i regiony o umiarkowanej zmienności, a także charakteryzujące się hiperzmiennościa, tak by odzwierciedlone zostały niedawne zmiany.

Naukowcy zaproponowali już wiele zegarów makromolekularnych, w tym cytochrom c (rozdział E2), ATPazę (rozdział E2), białko RecA (rozdział F9) i 16S/18S rRNA. Większość zegarów białkowych nie spełnia kryterium uniwersalności, szczególnie z uwagi na bakterie i archeony, który nie mają typowego łańcucha transportu elektronów. Obecnie najpowszechniej używanymi zegarami są: 16S rRNA u bakterii i archeonów, a u eukariotów jego odpowiednik – 18S rRNA.

Rybosomowy RNA (rRNA)

Małe, średnie i duże cząsteczki rRNA są idealnymi zegarami. Wykazano, że pełnią one te same funkcje u wszystkich znanych nauce organizmów, a także mają regiony o wysokiej konserwacji oraz regiony o wysokiej zmienności. Związek RNA z białkami rybosomowymi sprawia, że te części rRNA, które są osadzone głęboko w strukturze białkowej, wykazują niewielkie tendencje do zmian, ponieważ każda zmiana musi być odzwierciedlona w strukturze białka. Zmiany dotyczące białek rybosomowych lub rRNA zachodzące w regionach, w których prowadzą do niestabilności rybosomu, powodują śmierć organizmu i nie utrzymują się w następnych pokoleniach. Z drugiej strony istnieją też regiony hiperzmienne. To te części rRNA, które nie oddziałują bezpośrednio z białkami rybosomowymi, wobec czego mogą się w nich gromadzić mutacje.

Spośród trzech cząsteczek rRNA prokariotów (5S, 16S i 23S, zob. rozdział F5) najlepszą równowagą między zawartością informacji genetycznej (5S jest za krótki) i łatwością sekwencjonowania (23S jest za długi) odznacza się 16S rRNA. O atrakcyjności tej cząsteczki świadczy liczba wpisów w Ribosomal Database Project, w którym według edycji 10 (v23) w grudniu 2010 roku znajdowało się 1 483 016 sekwencji bakteryjnych. Należy wspomnieć, że wykorzystywanie tej cząsteczki ma kilka wad, przede wszystkim chodzi o to, że genom wielu bakterii zawiera więcej niż jedną kopię genu 16S rRNA, a kopie te często różnią się sekwencją nukleotydową. Może to wprowadzać zamęt i kontrowersje w zależności od tego, która z sekwencji zostanie wykorzystywana jako matryca, co potwierdza potrzebę podejścia wielofazowego.

Otrzymywanie sekwencji genu 16S rRNA

Fragmenty DNA zawierające część lub całość genu 16S rRNA pozyskuje się zazwyczaj metodą PCR. Startery projektuje się tak, by przyłączały się do konserwowanych regionów genu; czasem możliwe jest wykorzystywanie jednego zestawu starterów do amplifikacji 16S z wielu bakterii o dużym zróżnicowaniu filogenetycznym (zestaw starterów uniwersalnych). Nie istnieje jednak zestaw starterów, który pozwoliłby na amplifikację wszystkich genów wszystkich bakterii i wszystkich archeonów, w związku z czym opracowuje się wiele zestawów starterów specyficznych dla danego typu lub grupy. Dzięki kombinacji tych zestawów możliwe jest przeprowadzenie amplifikacji większości znanych nauce organizmów z czystej kultury wyizolowanej ze środowiska lub hodowli mieszanej.

Otrzymanie sekwencji metodą PCR zajmuje niewiele czasu, ale sama ta technika ma pewne ograniczenia. W PCR mogą powstawać chimery, produkty PCR zbudowane z końca 5’ genu danego gatunku i końca 3’ genu innego gatunku. Choć do eliminacji błędnych sekwencji z wyników końcowych służą programy komputerowe, w sytuacji gdy analizowane są organizmy rzadko występujące lub dotąd niezidentyfikowane, wykrycie błędów może nastręczać trudności. Z tego właśnie powodu istniały wątpliwości, czy w domenie archeonów powinien być wydzielany typ Korarchaeota. Dziesięć lat badań tych organizmów potwierdziło, że jest to wcześnie odgałęziająca się grupa archeonów.

Analizy bioinformatyczne genu 16S rRNA

Po amplifikacji i zsekwencjonowaniu produktu PCR genu 16S rRNA należy ustalić jego zależności filogenetyczne z innymi sekwencjami. Na wstępne rozeznanie bliskich pokrewieństw pozwala jego przyrównanie do jednej lub wielu znanych sekwencji. Można tego dokonać za pomocą programów takich jak BLAST (Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej). Aby zyskać rzeczywisty wgląd w zależności filogenetyczne, sekwencja genu 16S rRNA powinna być jednocześnie porównywana z jak największą liczbą innych sekwencji.

Na początku otrzymana sekwencja musi zostać przyrównana do wszystkich lub wybranych sekwencji pozyskanych wcześniej. Ponieważ geny 16S rRNA mogą różnić się długością, w celu osiągnięcia idealnego przyrównania można wykorzystać programy takie jak CLUSTAL (Europejski Instytut Bioinformatyki, EBI). Przyrównane sekwencje są następnie przycinane, tak by końce 5’ i 3’ były odpowiadającymi sobie zasadami, po czym zostają wczytane do programu generującego drzewo filogenetyczne.

Idealne przedstawienie zależności filogenetycznych powinno mieć charakter wielowymiarowy, ale biorąc pod uwagę ograniczenia trójwymiarowości naszego wszechświata i to, że w nauce przyjęła się konwencja przedstawiania dwuwymiarowego w formie drukowanej, „drzewo” jest dobrym kompromisem. Do jego opracowania służą dwa główne algorytmy: łączenie sąsiadów i maksymalna parsymonia. Łączenie sąsiadów to metoda oparta na dystansie ewolucyjnym i bazująca na macierzy różnic w zbiorze danych. Gałęzie powstającego w tej procedurze drzewa mają długość proporcjonalną do dystansu ewolucyjnego, dostosowaną statystycznie na okoliczność mutacji wstecznych. Maksymalna parsymonia to trudniejsze do omówienia zagadnienie, ponieważ gałęzie powstającego tą metodą drzewa mają długość proporcjonalną do minimalnej zmiany w sekwencji koniecznej do powstania nowej gałęzi.

Z zastosowaniem dwóch omówionych metod z jednego zbioru danych można otrzymać drzewa różniące się pewnymi szczegółami, np. liczbą gałęzi. Aby otrzymać przybliżoną sumę wszystkich możliwych drzew, stosuje się tzw. bootstraping, dzięki któremu uzyskuje się wartość ufności dla obecności każdej z gałęzi. Co więcej, drzewa oparte na metodzie łączenia sąsiadów i drzewa parsymoniczne na podstawie tego samego zbioru danych mogą dawać zupełnie inne wyniki, stąd też żadna z tych metod nie jest uważana za „słuszniejszą”. Dlatego żadne drzewo nie powinno być uważane za najlepszy możliwy wynik uzyskany na podstawie dostępnych danych i nie powinno ono unieważniać żadnych innych informacji.C1.
Historia mikrobiologii i pierwsze odkrycia

Podstawowe pojęcia

Historia bakteriologii

Za pierwszych mikrobiologów uznaje się Roberta Hooke’a (1660) i współczesnego mu Antoniego van Leeuwenhoeka, choć obowiązująca w ich czasach teoria samorództwa nie pozwalała osadzić drobnoustrojów i ich istnienia we właściwym kontekście. Eksperymenty Pasteura (1861) wykorzystującego kolby z łabędzią szyją wykazały jednak, że organizmy wywołujące psucie się żywności są mikroskopijne i przenoszą się przez powietrze. Ojcem założycielem bakteriologii jako nauki był Cohn (1875), a wraz z nimi inni naukowcy późnej epoki wiktoriańskiej: Koch, Beijerinck i Winogradski. Przez wiek XX i na początku wieku XXI bakterie były i są modelowym systemem w badaniach biochemicznych, czego ukoronowaniem było zsekwencjonowanie genomu Haemophilus influenzae w roku 1995 przez Ventera i współpracowników.

Główne podgrupy

Pierwotnie bakterie dzielono na dwie grupy na podstawie wyniku barwienia metodą Grama, ale współcześnie wyodrębnia się wśród nich wiele typów. Bakterie i archeony stanowią dwie odrębne domeny, a każdy z typów należących do tych domen obejmuje gatunki o zróżnicowanych własnościach metabolicznych, fizjologicznych i biochemicznych.

ZAGADNIENIA POWIĄZANE

B1. Systematyka prokariotów

C2. Różnorodność prokariotów

C6. Główne grupy prokariotów

Historia bakteriologii

Dopiero po wynalezieniu mikroskopu (przez braci Janssen ok. 1590 roku) udało się zaobserwować drobnoustroje jako maleńkie struktury występujące na różnych powierzchniach. Robert Hooke odwiedzał europejskie dwory, pokazując na nich zarodnikotwórcze struktury tworzone przez pleśnie, a w roku 1660 opublikował pierwszą pracę poświęconą drobnoustrojom (Micrographia). Pierwszym człowiekiem, który zobaczył prokarioty pod mikroskopem, był Antoni van Leeuwenhoek; dokonał tego w roku 1676. Wyniki swoich badań nad tymi „żyjątkami” (ang. animicules) przedstawił Towarzystwu Królewskiemu w Londynie. Teoria samorództwa zahamowała jednak dalsze badania, ponieważ zakładała, że za spontaniczne powstawanie pleśni i innych organizmów psujących niezabezpieczoną żywność odpowiada siła boska. Przekonanie, że organizmy żywe mogły narodzić się z materii nieożywionej, powstało w czasach Arystotelesa (384–322 p.n.e.), a zostało obalone (ale nie całkowicie odrzucone) w wyniku eksperymentów przeprowadzonych w 1861 roku przez Pasteura, z wykorzystaniem kolb z łabędzimi szyjami. Pozwoliły one na długoterminowe przechowywanie bulionu wołowego w niezmienionym stanie, a proces jego psucia rozpoczął się dopiero wówczas, gdy do bulionu wprowadzono ponownie przenoszący się w powietrzu, niewidzialny czynnik zanieczyszczający.

Za ojca założyciela bakteriologii jako nauki uważa się Ferdinanda Cohna, który zaproponował klasyfikację bakterii na podstawie ich morfologii, a w roku 1875 jako pierwszy użył terminu „Bacillus”. Krótko potem, w latach 1876–1884, swoje przełomowe prace zaczął publikować Robert Koch, który wykazał niepodważalny związek między bakteriami a chorobami (tzw. postulaty Kocha). Martinus Beijerinck opracował technikę hodowli wzbogacającej, a w roku 1889 wyhodował pierwszą czystą kulturę Rhizobium, rok przed tym, jak Winogradski dowiódł zależności między tlenem a nitryfikacją bakterii. Beijerinck dał również początek wirusologii jako nauce, a pracując dla holenderskiego przedsiębiorstwa produkującego drożdże, związał mikrobiologię i biotechnologię. Na przełomie XIX i XX wieku zaczęło wychodzić pierwsze pismo poświęcone mikrobiologii („Journal of Bacteriology”, publikowany do dziś przez Amerykańskie Towarzystwo Mikrobiologiczne), ponadto nazwano wówczas wiele organizmów, które do dziś badamy, przy czym klasyfikowano je inaczej, niż czynimy to obecnie. Przez wiek XX i na początku wieku XXI bakterie były i są modelowymi systemami dla badań biochemicznych, czego ukoronowaniem było zsekwencjonowanie genomu Haemophilus influenzae w roku 1995 przez Ventera i współpracowników.

Główne podgrupy

Wysiłki pierwszych bakteriologów (Cohna, Kocha i Beijerincka) skupiały się na identyfikacji i klasyfikacji bakterii (rozdział B1). Opierali się oni jednak na morfologii (ogólnym kształcie) organizmów, a jako że większość bakterii pod mikroskopem wygląda jak pałeczka, zaś na płytkach agarowych tworzy kolonie białe lub kremowe, podejście to miało swe ograniczenia. Opracowane w 1884 roku barwienie (metoda Grama) przez duńskiego lekarza Hansa Christiana Grama umożliwiło podzielenie prokariotów na dwie grupy, które jak okazało się później, różniły się strukturą ściany komórkowej. Bakterie Gram-dodatnie barwiły się na fioletowo (fioletem krystalicznym), zaś ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych pozwalała na usunięcie barwnika. Bakterie Gram-dodatnie o małej zawartości par GC tworzą obecnie typ Firmicutes, zaś te o dużej zawartości par GC – typ Actinobacteria (rozdział C6), ale okazało się, że bakterie Gram-ujemne są znacznie bardziej zróżnicowane pod względem fenotypowym i genetycznym. Przez pewien czas zaliczano do nich także archeony. Obecnie typowe bakterie Gram-ujemne znajdują się w typie Proteobacteria.

Dziś odróżniamy bakterie od archeonów i potrafimy je podzielić na dalsze grupy (typy taksonomiczne) na podstawie filogenezy. Trzeba jednak podkreślić, że istnieje wiele własności fizjologicznych i metabolicznych, które są rozpowszechnione wśród przedstawicieli należących do różnych typów domeny Bacteria. Na przykład do żadnego konkretnego typu nie należą bakterie zdolne do wywołania chorób człowieka, ani te zdolne do denitryfikacji, ani też beztlenowce czy bakterie zdolne do przeprowadzania fotosyntezy. Większość gatunków bakterii cechuje się unikatowymi własnościami, które mogą znacząco odróżniać je od innych przedstawicieli tego samego rodzaju, a niektóre z tych cech występują u różnych bakterii o odmiennej filogenezie.